家鸡G蛋白偶联受体85基因的结构、序列与组织表达分析

宋亮，张剑南，刘海坤，莫春横，李娟，王亚军

(四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都610065)

G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor，GPCR)是细胞表面蛋白的一个大家族，由于其结构、配体和表达组织的多样性，是多细胞生物协调进化的主要参与者(Hellebrandetal.，2000)。GPCRs具有典型7次跨膜结构域(Straderetal.，1995；Gether & Kobilka，1998)。细胞外刺激如神经递质、激素或光可激活GPCRs，诱导GTP结合蛋白介导的细胞内信号级联反应(Matsumotoetal.，2000)。许多GPCRs的配体尚不清楚，这些受体被称为孤儿受体(Hellebrandetal.，2000)。GPCRs常作为药物的靶点(Wilsonetal.，1998；Wiseetal.，2002；Vassilatisetal.，2003)，在所有使用的药物中，50%～60%依赖GPCR发挥其效应(Gudermannetal.，1995)。

GPR85是2000年报道的一个新GPCR亚家族中的一员，该亚家族被称为脑部表达的超保守受体(super conserved receptor expressed in brain，SREB)家族(Matsumotoetal.，2000)。据统计，GPR85基因变异与精神分裂症疾病风险有关联(Radulescuetal.，2013)。过度表达GPR85的转基因小鼠表现出与某些精神分裂症模型相符合的行为(Matsumotoetal.，2008)。GPR85基因敲除小鼠脑质量显著增加，并有记忆力增强的趋势，表明GPR85是脑质量的决定因素(Matsumotoetal.，2008)。也有研究表明，GPR85是成人神经发生和相应认知功能的负调控因子，可能与精神分裂症以外的神经精神状况有关(Chenetal.，2012)。GPR85还可能与突触后密度蛋白(PSD-95)-神经配蛋白复合物相互关联，对孤独症谱系障碍(autism spectrum disorder，ASD)产生影响(Fujitajimboetal.，2015)。

SREB家族受体是通过多巴胺D4受体序列相似性搜索被发现的(Matsumotoetal.，2000，2005)，由SREB1(GPR27)、SREB2(GPR85)、SREB3(GPR173)3个成员组成(Matsumotoetal.，2000)，三者之间有高度的氨基酸序列一致性(52%～63%)，但与其他GPCR亚家族的一致性却低于25%(Matsumotoetal.，2005)。GPR85迄今仍是一个孤儿受体，它在哺乳动物中高度保守，在人Homosapiens、小鼠Musmusculus和大鼠Rattusnorvegicus序列中100%相同(Hellebrandetal.，2000；Jeonetal.，2002)。哺乳类GPR85与斑马鱼Daniorerio的也有94%的氨基酸序列一致性(Matsumotoetal.，2000)。这种相似度比其他GPCR更高(Yamaguchi & Brenner，1997；De Lucchinietal.，2001；Loganetal.，2003)。SREB1与SREB3在哺乳类中也高度保守，在人和啮齿类动物中分别具有97%和99%的序列一致性(Matsumotoetal.，2005)。虽然SREB家族序列在脊椎动物中高度保守，但其同源基因在线虫或黑腹果蝇Drosophilamelanogaster基因组序列中却未发现，这表明SREB家族可能起源于脊椎动物的祖先(Matsumotoetal.，2000，2005)。

鉴于GPR85在非哺乳类脊椎动物类群尤其是鸟类中的研究尚属空白，因此，本研究以家鸡Gallusgallusdomesticus为模型动物，克隆家鸡GPR85基因的全长cDNA序列，并揭示其结构，同时对GPR85基因在家鸡各组织中的表达情况进行探究。以揭示GPR85在鸟类与哺乳类中的功能异同，寻找家鸡GPR85的内源性配体以及探究其在家鸡组织中的生理作用奠定基础，也为GPR85在哺乳类中的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

购自四川牧星养鸡场的罗曼粉性成熟的公鸡、母鸡各3只；购自美国Molecular Research Center公司的RNA提取所用的RNAzol；购自日本TOYOBO公司的高保真KOD-FX DNA聚合酶、10×A-attachment Mix、pTA2载体；购自TaKaRa公司的限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Easy-Taq DNA聚合酶、dNTPs、M-MLV逆转录酶等；购自Clontech公司的SMART RACE cDNA Amplification Kit；本实验室制备保存大肠杆菌EscherichiacoliDH5α感受态细胞；购自生工生物工程(上海)股份有限公司的DNA 纯化胶回收试剂盒；由成都擎科公司完成引物合成、DNA测序；购自Bio-Rad公司的PCR仪(S1000 Thermal Cycler)、荧光定量PCR仪(Bio-Rad CFX96)、荧光染料EvaGreen、96孔荧光定量PCR板、塑料封膜等。

1.2 方法

1.2.1 组织RNA提取取家鸡全脑、端脑、中脑、小脑、后脑、下丘脑、垂体、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、皮肤、肌肉、脂肪、胰腺、十二指肠、肾上腺、卵巢、精巢等组织于液氮中充分研磨，取约60 mg组织于1.5 mL EP管中，立即加入600 μL的RNAzol用匀浆器匀浆，冰上放置10 min后，加入240 μL的DEPC-H2O，剧烈涡旋15 s，放置15 min，12 000 r·min-1离心10 min，取700 μL上清液，加入3.5 μL的4-溴苯甲醚，剧烈涡旋15 s，放置5 min，12 000 r·min-1离心10 min，小心快速取600 μL上清液，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，放置20 min，12 000 r·min-1离心10 min，弃上清，加入600 μL 75%乙醇(DEPC-H2O配制)洗涤沉淀，4 000 r·min-1离心3 min，弃上清，室温放置晾干，加入30 μL DEPC-H2O使RNA充分溶解。

1.2.2 cDNA模板制备以家鸡各组织总RNA为模板进行逆转录构建cDNA模板。取各组织总RNA 2 μg，Oligo-dT 1 μL，DEPC-H2O补足至5 μL，70 ℃加热10 min，取出后冰浴2 min，然后加入5×缓冲液2 μL，dNTPs 0.5 μL，M-MLV逆转录酶(200 U·μL-1) 0.5 μL，DEPC-H2O 2 μL，放入PCR仪中42 ℃孵育1.5 h，70 ℃加热10 min。反应产物用DEPC-H2O稀释至60 μL作为cDNA模板。

1.2.3 引物设计依据NCBI预测的家鸡GPR85基因mRNA序列(GenBank登录号：XM_004937542)和已知的β-actin基因mRNA序列，设计特异性引物用于扩增cDNA序列或检测其组织表达。利用克隆得到的GPR85基因编码区序列，设计家鸡GPR85基因5’和3’-RACE引物(表1)。

表1 本实验所用引物序列Table 1 Primers used in the study

注： 下划线表示引物设计时添加的限制性内切酶酶切位点

Note： Restriction sites added at the 5’-end of the primers are underlined

1.2.4 家鸡GPR85基因编码区的克隆以家鸡全脑cDNA为模板，按照KOD FX高保真DNA聚合酶(TOYOBO)的说明书配制PCR反应体系，PCR条件为：94 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸90 s，36个循环；最后68 ℃延伸20 min。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，利用DNA纯化试剂盒回收产物，之后用限制性内切酶HindⅢ和EcoRⅠ进行双酶切，酶切产物经胶回收试剂盒回收后连接到pcDNA3.1(+)载体(Invitrogen)后克隆测序。

1.2.5 家鸡GPR85基因5’-RACE和3’-RACE按照SMART RACE cDNA Amplification Kit试剂盒(Clontech)说明书构建家鸡全脑组织5’或3’-RACE模板，之后利用基因特异性引物PCR扩增GPR85基因的5’-UTR和3’-UTR，具体反应体系及方法参考邓秋洋等(2018)，第一轮PCR反应条件为：94 ℃2 min；94 ℃10 s，72 ℃ 3 min，5个循环；94 ℃10 s，70 ℃ 3 min，5个循环；94 ℃10 s，68 ℃ 3 min，25个循环；最后68 ℃ 10 min，取3 μL反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。将第一轮PCR产物稀释 500倍作为模板，进行第二轮巢式PCR反应，PCR反应条件同上。巢式PCR产物经加A反应后连接至pTA2载体，克隆后进行序列测定。

1.2.6 生物信息学分析使用DNAMAN和APE进行DNA序列分析和蛋白质翻译；使用BioEdit和DNAMAN进行蛋白质序列比对；使用TMpred(https：//embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)进行蛋白质跨膜区预测；使用Genomicus(http：//www.genomicus.biologie.ens.fr/genomicus-91.01/cgi-bin/search.pl)进行基因共线性分析；序列分析使用在线数据库GenBank(http：//www.ncbi.nih.gov)和Ensembl(http：//www.ensembl.org)。

1.2.7 家鸡GPR85基因的表达特征每只家鸡取19个组织，针对6只家鸡不同组织的cDNA模板，通过qPCR方法检测GPR85基因的表达特征，具体方法参考黄思邈等(2015)和祝国强等(2017)。qPCR反应扩增体系如下：cDNA模板6 μL，MilliQ-H2O 9.7 μL，10×buffer 2 μL，dNTPs 0.4 μL，上、下游引物各0.3 μL，荧光染料EvaGreen 1 μL，Easy-Taq酶0.3 μL，总体积为20 μL。PCR反应条件如下：94 ℃2 min；94 ℃20 s，62 ℃15 s，72 ℃20 s，40个循环。使用2-ΔΔCT法计算GPR85基因的相对表达水平。

2 结果与分析

2.1 家鸡GPR85基因的克隆与序列分析

以家鸡脑组织cDNA为模板，采用引物(GPR85-U+L)扩增GPR85基因编码区，得到长度约为1 100 bp的条带(图1)，与预期一致。测序结果显示，家鸡GPR85基因(GenBank登录号：MH293604)的编码区长为1 113 bp，可编码370个氨基酸。氨基酸序列分析发现，家鸡GPR85蛋白具有经典的7次跨膜区，且第三胞内环相对较长(图2)。家鸡GPR85与人(99.73%)、小鼠(99.73%)、大鼠(99.73%)、热带爪蟾Xenopustropicalis(99.19%)、斑马鱼(93.80%)GPR85的氨基酸序列一致性极高。人、小鼠、大鼠GPR85的氨基酸序列完全相同，家鸡GPR85的氨基酸序列与它们仅有1个氨基酸的差别，即第一胞外环中的苏氨酸(Thr)与天冬酰胺(Asn)之差。将家鸡GPR85基因编码区cDNA序列与家鸡基因组序列进行比对，发现该基因位于家鸡第1号染色体上，通过染色体共线性分析，发现家鸡GPR85基因与人、小鼠、大鼠、斑马鱼GPR85基因为直系同源基因(图3)，表明GPR85基因在不同脊椎动物中保守存在。

图1 家鸡GPR85基因编码区的PCR 扩增Fig. 1 PCR amplification of the coding region of chicken GPR85

2.2 家鸡GPR85基因5’-UTR和3’-UTR的鉴定

以家鸡全脑cDNA为模板，通过5’和3’-RACE成功获得家鸡GPR85基因的5’-UTR(389 bp)和3’-UTR序列(1 407 bp)，通过与家鸡基因组序列比对，发现家鸡GPR85基因由2个外显子构成，第1个外显子的长度为214 bp，第2个外显子的长度为2 695 bp，编码区位于第2个外显子上，2个外显子之间有1个长为1 508 bp的内含子(图4，图5)。

2.3 家鸡GPR85基因的组织表达分析

实时荧光定量PCR结果显示，家鸡GPR85基因mRNA在全脑、垂体、肾上腺、精巢中相对高表达，而在其他外周组织中表达水平低(图6：A)。此外，还检测了GPR85基因在脑各区域的表达情况，发现GPR85基因mRNA在家鸡端脑、中脑、小脑、后脑和下丘脑中均有表达，其中小脑表达水平最高(图6：B)。

图2 家鸡GPR85(cGPR85)与人(hGPR85)、小鼠(mGPR85)、大鼠(rGPR85)、热带爪蟾(fGPR85)和斑马鱼(zfGPR85)的氨基酸序列比对Fig. 2 Amino acid sequence alignment of chicken GPR85 (cGPR85) with that of Homo sapiens (hGPR85)，Mus musculus (mGPR85)，Rattus norvegicus (rGPR85)，Xenopus tropicalis (fGPR85) and Danio rerio (zfGPR85)

阴影表示7次跨膜区(TM)

The putative 7 transmembrane domains (TMs) were shaded

图3 GPR85基因在家鸡、人、小鼠、大鼠和斑马鱼中的染色体共线性分析Fig. 3 Synteny analysis of GPR85 gene inGallus gallus domesticus，Homo sapiens，Mus musculus，Rattus norvegicus and Danio rerio

Chr.染色体chromosome

图4 家鸡GPR85基因结构Fig. 4 Structure of chicken GPR85 gene

3 讨论

GPCR可参与众多生理过程调节，如有丝分裂、肌肉收缩、离子通道调控、基因转录等(Alexanderetal.，2015)。GPR85作为孤儿受体之一，据报道在哺乳动物中高度保守(Hellebrandetal.，2000；Jeonetal.，2002)，但其在非哺乳类脊椎动物中的研究几属空白。本研究以家鸡为模型，首次从家鸡脑组织中成功克隆到GPR85基因的全长cDNA序列，揭示其基因结构，探究其在家鸡不同组织中的表达特征。

图5 家鸡GPR85基因全长cDNA序列和氨基酸序列Fig. 5 The full-length cDNA sequence and amino acid sequence of chicken GPR85 gene

箭头示内含子位置，星号(＊)示终止密码子TGA

Arrowhead indicates the location of intron 1 and asterisk denotes the stop codon (TGA)

图6 实时荧光定量PCR分析家鸡GPR85基因的组织表达特征Fig. 6 Quantitative real-time PCR assay of GPR85 gene expression in chicken tissues

(A) Br. 全脑，Pi. 垂体，He. 心脏，Li. 肝脏，Sp. 脾脏，Lu. 肺，Ki. 肾脏，Sk. 皮肤，Mu. 肌肉，Fat. 脂肪，Pa. 胰腺，Du. 十二指肠，Adr. 肾上腺，Ov. 卵巢，Te. 精巢； (B) Tc. 端脑，Mb. 中脑，Cb. 小脑，Hb. 后脑，Hp. 下丘脑； 以β-actin基因作为内参，GPR85基因的相对表达水平以倍数形式表示(以全脑或者端脑为对照)

(A) Br.whole brain，Pi. pituitary，He. heart，Li. liver，Sp. spleen，Lu. lung，Ki. kidney，Sk. skin，Mu. muscle，Fat. fat，Pa. pancreas，Du. duodenum，Adr. adrenal gland，Ov. ovary，Te. testis； (B) Tc. telencephalon，Mb. midbrain； Cb. cerebellum，Hb. hindbrain，Hp. hypothalamus； the mRNA level ofGPR85gene was normalized to that ofβ-actinand expressed as fold difference compared with that of whole brain or telencephalon

本研究首次从全脑组织中成功克隆到家鸡GPR85基因的完整编码区序列，其编码1个长度为370个氨基酸的具有7次跨膜结构域的受体蛋白。序列分析显示家鸡GPR85与人(99.73%)、小鼠(99.73%)、大鼠(99.73%)、热带爪蟾(99.19%)、斑马鱼(93.80%)GPR85的氨基酸序列一致性极高。人、小鼠、大鼠的GPR85的氨基酸序列完全相同，家鸡GPR85的氨基酸序列与它们仅有1个氨基酸的差别。共线性分析发现，家鸡GPR85基因位于家鸡第1号染色体上，与人、小鼠、大鼠、斑马鱼GPR85为直系同源基因。由于在非脊椎动物线虫或黑腹果蝇基因组序列中未发现GPR85同源基因(Matsumotoetal.，2000)，这表明GPR85基因可能仅在脊椎动物中发挥重要生理功能。

利用RACE技术成功获得了家鸡GPR85基因的5’-UTR和3’-UTR序列。家鸡GPR85基因的5’-UTR和 3’-UTR序列均与NCBI中预测的GPR85基因序列存在长度上的差异。本研究发现家鸡GPR85基因具有较长的3’-UTR序列(1 407 bp)，暗示其可能参与GPR85mRNA的稳定性、亚细胞定位及翻译的调节。利用实时荧光定量PCR方法，获得了家鸡GPR85基因的组织表达图谱，发现其在全脑(包括端脑、中脑、小脑、后脑和下丘脑)、垂体、肾上腺、精巢中高表达，而在其他组织中具有较低的表达水平。家鸡GPR85基因在脑中的高表达与哺乳动物GPR85基因在脑中的表达情况相似，暗示GPR85同样也在家鸡脑的发育和功能调节中发挥重要作用(Matsumotoetal.，2000，2005)。家鸡GPR85基因在精巢中的高表达也与哺乳动物高度一致(Matsumotoetal.，2000)，暗示其在精巢中的功能存在一定保守性。而在哺乳动物中，尚未有GPR85基因在垂体中高表达的报道。本研究首次发现GPR85基因在垂体组织中的高水平表达，亦暗示其可能参与调控垂体激素的合成与分泌等。

综上，本研究首次在非哺乳类脊椎动物物种(家鸡)中，揭示家鸡GPR85基因结构和氨基酸序列，并发现其在全脑、垂体、精巢和肾上腺中高表达。家鸡和哺乳动物GPR85基因结构和组织表达的高度保守性，提示GPR85在脊椎动物脑、精巢等组织中发挥关键生理作用，值得深入探究。