猪博卡病毒G1基因群和猪流行性腹泻病毒双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

师乾凯，范慧霞，顾文源,3，侯林杉，左玉柱*，范京惠*

(1.河北农业大学动物医学院，河北保定071001；2.河北农业大学信息科学与技术学院，河北保定071001；3.河北省动物疫病预防控制中心，河北石家庄050035)

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)属冠状病毒属，各年龄猪均易感。猪博卡病毒(Porcine bocavirus，PBoV)，属于细小病毒科、细小病毒亚科博卡病毒，其主要引起猪的腹泻、呼吸系统疾病及仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)，各年龄段猪均易感，在仔猪体现为高发病率和病死率[1-2]，且全球流行。已发现的PBoV 可分为 3 个基因群，命名为 G1、G2 和 G3，同群PBoV 之间同源性较高，而不同群之间则差异较大，目前PBoV 在猪群中主要以PBoV G1 流行为主[3-5]。因此，对PBoV G1 的准确鉴定有助于对该病毒流行情况及致病性的进一步确定。

由于猪在感染PBoV 之后主要症状与PEDV 感染症状极为相似，临床上难以区分，且PBoV 与PEDV 易发生混合感染[6]，因此建立一种特异性强、灵敏度高、耗时短的检测方法对准确检测PBoV 和PEDV 及其流行病学调查等均具有重要意义。目前，针对 PBoV G1 基因群和PEDV 感染的双重TaqMan荧光定量PCR 检测方法尚未报道。因此，本研究根据PBoV G1 基因群和PEDV 的保守基因序列设计了两对特异性引物及探针，建立了能够同时区分PBoV 和 PEDV 的双重TaqMan 荧光定量 PCR 检测方法，为PBoV 和PEDV 感染的检测提供了快速、敏感的方法。

1 材料与方法

1.1 病毒及样品 PBoV HB-HD 株(MG014696)、PEDV BJ2010 株(JF690778)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)HB-BD 株(MF948005)、猪伪狂犬病毒(PRV)CH/HB/BD 株(MG738722)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)CH/HB/YX 株(MG786932)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV) HB06 株(MK166015)、猪轮状病毒(PRoV)JL94 株(AY538664)均由河北农业大学动物医学院动物传染病实验室保存，其中PBoV HB-HD 株(MG01 4696)与 PBoV G1 群代表株 PBo-likeV(FJ87 2544)、Buk8_1(JX854557)和 PBoV-SX(HQ223038)的同源性分别为99.3 %、99.3 %和99.0 %。……