采用肝癌球体细胞筛选鉴定识别肝癌干细胞的单抗

孙力超 杨 婧 孙立新 张 媛 杨治华 冉宇靓

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，病死率居恶性肿瘤第三位。肝癌治疗失败的主要原因是复发、转移[1]。肝癌的治疗以手术、介入、放疗的局部治疗为主，而肝癌的靶向药物仅为索拉非尼且疗效较差。大量研究发现，肿瘤组织中存在着肿瘤干细胞，它具有自我更新、高致瘤性、高侵袭、高转移的能力，且能抵抗放化疗，是肿瘤转移和复发的根源[2]。因此如能获得靶向肝癌干细胞的单抗治疗肝癌将有望克服临床上现有这些治疗手段的缺陷，改善肝癌患者的预后。为了获得抗肝癌干细胞单抗，在前期研究中，我们从人肝癌组织中分离获得肝癌细胞，经过体外无血清成球培养、富集肝癌干细胞后，免疫小鼠，并利用杂交瘤技术制备了富含抗肝癌干细胞单抗的单抗库[3]。研究证实无血清悬浮培养可以富集、培养肿瘤干细胞[4]。为了高效筛选抗肝癌干细胞单抗，本研究采用人肝癌细胞株HCC97L无血清成球细胞作为肝癌干细胞模型去筛选识别抗肝癌干细胞的单抗，并鉴定其功能，为靶向肝癌干细胞治疗肝癌提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞免疫荧光检测

以1×104/孔MHCC97L细胞接种于96孔细胞培养板，37℃、5%CO2培养24 h。活细胞免疫荧光：加入单抗28C10以及对照一抗，室温孵育1 h；活细胞洗液(含1%BSA的PBS)洗涤5次，每次5 min；室温下，4%的多聚甲醛固定15 min；固定细胞洗液(含0.1%BSA、0.05%tween-20的PBS)洗涤5次，每次5 min；100 l biotin-IgG(1∶300稀释)，室温反应30 min。洗涤3次，加入100 l Cy3-Avidin(1∶1 000稀释)，室温避光反应30 min。用50 μL含10 μg/mL DAPI、50%甘油的PBS封闭。固定细胞免疫荧光：先将细胞固定，再孵育一抗，其他方法同活细胞免疫荧光。……