利用小RNA测序技术检测贵州西番莲病毒

严佳文 袁启凤 解璞 王立娟 马玉华 王正媛

摘  要  病毒病害是西番莲重要病害之一，明确病毒种类可为病害防治提供理论依据。本研究应用小RNA测序技术对6份疑似病毒侵染的西番莲叶片样本进行病毒种类鉴定，发现混合样本中含有黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）和夜来香花叶病毒（Telosma mosaic virus， TeMV）。应用RT-PCR分别扩增6份样本中2种病毒的外壳蛋白（coat protein， CP）基因序列，进一步证实6份样本中均含有CMV和TeMV。CMV的CP基因开放阅读框大小为657 bp，与已报道的其他分离物的一致性为82.3%～95.9%;TeMV的CP基因开放阅读框为816 bp，与其他分离物的一致性分别为87.8%～99.3%和87.8%～98.3%。上述结果表明，贵州西番莲中的病毒是CMV和TeMV的分离物，分别命名为CMV-GZ（CP基因登录号为MH623077）、TeMV-GZ1（MH623078）和TeMV-GZ2（MH623079）。

关键词  西番莲;病毒;小RNA测序;鉴定

中图分类号  S436.67      文献标识码  A

Abstract  Virus disease is one of the main diseases of Passiflora edulis， and the identification of virus species can provide a theoretical basis for the disease prevention. In this study， six suspected virus-infected leaf samples were mixed and analyzed by small RNA deep sequencing. Cucumber mosaic virus （CMV） and Telosma mosaic virus （TeMV） were detected from the mixed sample. Viruses identified by small RNA sequencing were validated by virus coat protein gene （CP） specific RT-PCR from the above six samples. CMV and TeMV was detected from all six samples， respectively. The open reading frame of CP gene of CMV and TeMV obtained by RT-PCR was 657 bp and 816 bp， correspondingly. The nucleotide sequence identity of CMV-GZ （accession number： MH623077）， TeMV-GZ1 （accession number： MH623078） and TeMV-GZ2 （accession number： MH623079） was 82.3%95.9%， 87.8%99.3% and 87.8%98.3%， respectively， with the reported CMV and TeMV isolates. CMV and TeMV in P. edulis was first reported Guizhou. The combined infection of the two viruses may be a potential threat to P. edulis.

Keywords  Passiflora edulis; virus; small RNA sequencing; identification

DOI  10.3969/j.issn.1000-2561.2019.08.018

西番蓮（Passiflora spp.）是西番莲科（Passifl oraceae）西番莲属（Passiflora）果树，原产于南美洲，约有530个种和400多个人工杂种，其中可食用的有80余种[1-2]。西番莲兼具食用和药用价值，具有重要的经济意义[3]。我国早在1901年就引种西番莲，目前在台湾、广东、海南、福建、贵州、广西、云南和四川等省区广泛种植[4]。近年来，西番莲种植面积迅速扩大，各省区之间引种、苗木销售活动频繁，一定程度上加速了各种病害的传播和蔓延[5]。病毒病害严重影响西番莲的产量和品质，是产业健康发展的主要限制因素之一[6]。

国内外已报道了26种侵染西番莲的病毒，包括马铃薯Y病毒属（Potyvirus）、菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）、香石竹潜隐病毒属（Carl avirus）、黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）、芜菁黄花叶病毒属（Tymovirus）、柑橘粗糙病毒属（Cilevirus）、烟草花叶病毒属（Tobamovirus）、线虫传多面体病毒属（Nepovirus）等[5]。我国主要有黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）、东亚西番莲病毒（East Asian Passiflora virus， EAPV）、西番莲斑驳病毒（Passion fruit mottle virus， PaMV）、广东番木瓜曲叶病毒（Papaya leaf curl Guangdong virus， PaLCuGdV）、大戟曲叶病毒（Euphorbia leaf curl virus， EuLCV）和夜来香花叶病毒（Telosma mosaic virus， TeMV）[6-9]。国内西番莲病毒病害主要发生在台湾、福建、海南和广东等省区[5]，贵州暂未见西番莲病毒病相关报道。笔者通过田间调查发现贵州各个主产区均有疑似病毒病侵染的植株，部分果园尤为明显。鉴定侵染贵州西番莲病毒种类，对于病害防控具有重要意义。

目前已经报道的西番莲病毒鉴定方法主要有生物学检测、电子显微镜检测、血清学检测和分子生物学检测等[5]。这些方法在植物病毒鉴定方面均得以成功应用，却也存在一定的局限性。与逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction， RT-PCR）等传统分子生物学检测方法相比，小RNA测序技术（small RNA sequencing， sRNA-seq）不仅可以同时鉴定多种DNA或RNA病毒，还能发掘新病毒或新分离物，已被廣泛应于各种植物病毒鉴定[10-15]。本研究应用小RNA测序技术分析了贵州省疑似病毒侵染的西番莲样本，结合RT-PCR验证了鉴定结果，克隆了病毒外壳蛋白（coat protein， CP）基因开放阅读框序列，并对所鉴定病毒的不同分离物进行了系统发育分析，为贵州西番莲病毒病的防控奠定了基础。

1  材料与方法

1.1  材料

2017年10月—2018年7月在贵州贞丰、镇宁、望谟、罗甸、平塘和从江采集疑似病毒侵染的西番莲叶片6份，其中采自平塘的西番莲品种为‘平塘1号，其他样本均为‘紫香1号，样品信息见表1。以健康西番莲植株作为阴性对照。

1.2  方法

1.2.1  西番莲总RNA提取  采用TRIzol试剂（Invitrogen，美国）提取6份疑似病毒侵染叶片混合样品的总RNA，具体方法参照试剂说明书。应用Nanodrop 2000检测总RNA的浓度和纯度，Agilent 2100测定RIN值。选取RIN值≥8.0、OD260/280≥1.8、浓度≥50 ng/μL的RNA用于测序文库构建。

1.2.2  西番莲sRNA 测序  应用Small RNA Sample Pre Kit （Illumina，美国）构建文库，使用Qubit 2.0进行初步定量，稀释文库至1 ng/μL，然后使用Agilent 2100对文库的插入片段进行检测。库检合格后，用HiSeq2000进行高通量测序，测序单端读长为50 nt。sRNA测序委托北京百迈克生物科技有限公司完成。

1.2.3  sRNA的拼接和注释  去除原始数据中的低质量序列，保留长度为18～35 nt的序列。应用Velvet 1.2软件对高质量的sRNAs进行拼接，获得一系列contigs。将上述contigs在NCBI数据库中进行BLASTn和BLASTx比对，得到可能存在的病毒序列并进行分类和注释，确定样本中可能存在的病毒种类。

1.2.4  病毒RT-PCR验证  根据拼接得到的病毒核酸序列设计CMV和TeMV的特异引物（表2），用于RT-PCR检测。分别以6份疑似病毒侵染的西番莲叶片总RNA为模板，合成cDNA第一链，逆转录反应体系为：总RNA 2 μg，5×M-MLV buffer 4 μL，M-MLV反转录酶（Promega，美国）40 U，10 μmol/μL随机六聚体引物2 μL，10 mmol/L dNTPs 2 μL，RNA酶抑制剂20 U，以无RNA酶的去离子水补充体积至25 μL。反应程序为：37 ℃孵育1 h，70 ℃灭活10 min后备用。以cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系25 μL：10×PCR buffer 2.5 μL、10 mmol/L的dNTPs 2 μL、2.5 μmol/L的上下游引物各1 μL，Taq DNA聚合酶1 U，cDNA 2 μL，去离子水补充体积至25 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s，复性30 s（退火温度见表1），72 ℃延伸90 s，35次循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物以1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，纯化、克隆并测序。TA克隆及阳性克隆筛选方法参照pGM-T连接克隆试剂盒 （天根生化科技有限公司，北京），随机选择5个阳性克隆送上海生工测序。获得的序列应用DNAMAN 8进行比对分析。

1.2.5  病毒CP基因克隆及系统发育分析  根据拼接得到的病毒核酸序列设计CMV和TeMV的CP基因开放阅读框（open reading frame， ORF）扩增引物（表2），用于CP基因克隆。PCR扩增、产物克隆测序方法参照1.2.4。在NCBI数据库中检索已经报道的侵染西番莲的CMV以及侵染西番莲等植物的TeMV的CP基因序列，应用MEGA 7.0对两种病毒不同分离物进行系统发育分析。采用ClustalW进行多序列比对，设置自展值为1000，以Neighbor Joining法构建系统进化树。

2  结果与分析

2.1  西番莲sRNA测序结果分析

经检测，西番莲总RNA浓度为422 ng/μL，OD260/280为8.4，总量为9.7 μg，完全符合sRNA测序要求。sRNA测序获得28 964 784个reads，除去接头和低质序列后得到了25 994 547个clean reads，占reads总数的89.76%。sRNA长度为18～35 nt，其中长度为21 nt的数量最多，高达117 303个，其次是22 nt（92 920个）、20 nt （60 100个）和19 nt（38 724个），25～35 nt的sRNA较少，总和为27 940个（图1）。

序列在NCBI数据库中的BLAST比对结果显示，183个contig可以比对到2种病毒序列，其中69个contig可比对到CMV序列，同源性为90%～ 100%;114个contig可以比对到TeMV序列，同源性为65%～93%。以CMV和TeMV基因组序列为参照，将所有contig组装成4段核酸序列，其中3段序列与CMV的RNA1、RNA2和RNA3全长的覆盖率分别为85.6%、86.1%和72.5%;1段序列与TeMV基因组的覆盖率为63.3%（表3）。sRNA序列分析结果表明，6份混合样本中可能存在CMV和TeMV。

2.3  RT-PCR分析

为验证sRNA注释结果的可靠性，根据拼接序列设计了CMV和TeMV的特异性引物，分别对6份样本进行RT-PCR检测。结果显示，所有样品均扩增到2种病毒的核酸片段，大小分别为506 bp和398 bp，与预期大小一致（图2）。

将PCR产物测序发现：6个样本的CMV扩增产物序列完全一致，该序列与侵染香蕉（Musanana）的CMV分离物HS-5（KT302188）的CP基因序列一致性为98%，将侵染贵州西番莲的CMV命名为CMV-GZ;样本PT的TeMV擴增产物序列与广西分离物GX1（KJ789129）的CP基因序列一致性最高为99%，将该侵染贵州西番莲的TeMV命名为TeMV-GZ1;样本ZF、ZN、WM、LD和CJ的TeMV扩增产物得到2种核酸序列，其中一种与样本PT的扩增序列完全一致，另一种与GX1的CP基因序列一致性为94%，将此分离物命名为TeMV-GZ2。以上结果说明RT-PCR检测结果准确可靠，与sRNA拼接及注释结果一致。样本ZF、ZN、WM、LD和CJ中含有TeMV-GZ1和TeMV-GZ2 2种分离物。

将PCR扩增产物克隆测序后，分别在NCBI数据库进行BLAST分析。其中CMV-GZ（MH623077）的CP基因ORF及其氨基酸序列与侵染胡椒（Piper nigrum）的CMV分离物FT （KU255786）的一致性分别为97.1%和100%，与其他侵染西番莲的分离物CP基因全序列或部分序列的一致性为82.3%～95.9%，与相应氨基酸序列的一致性为97.3%～98.6%（表4）;TeMV-GZ1（MH623078）与TeMV-GZ2（MH623079）的CP基因ORF及其氨基酸序列一致性分别为96.5%和96.7%，两者与其他TeMV分离物的CP基因全序列或部分序列的一致性分别为87.8%～ 99.3%和87.8%～98.3%，与相应氨基酸序列的一致性为88.3%～98.2%和88.3%～96.7%（表5）。

为进一步明确CMV-GZ、TeMV-GZ1和TeMV-GZ2与已经报道的CMV和TeMV分离物的进化关系，分别以花生矮缩病毒（Peanut stunt virus， PSV， KM823528）和大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus， SMV， FJ548849）为外组，基于CP基因序列构建了系统进化树。侵染西番莲的CMV分离物分成2支，其中CMV-GZ（MH623077）与巴西的4个分离物（AF418574， AF418575， AF418576， AF418577）、韩国分离物CMV-KoPF（KR 535 607）、中国福建分离物CMV-xm-pf来自不同国家和地区的14个TeMV分离物分成两个类群（图5），来自印度尼西亚的8个分离物和来自越南的1个分离物以较高的后验概率聚为一支，本研究获得的TeMV-GZ1（MH623078）、TeMV-GZ2（MH623079）分离物与广西分离物GX1（KJ789129）、泰国分离物Pangda12（AM 40 9187Pangda15（AM409188）组成第2大类群，其中分离物GZ1与中国广西分离物GX1以较高的后验概率（PP=100%）先聚为一个分支，而后与分离物GZ2和泰国分离物Pangda12和Pangda15进一步相聚成簇（图5）。相同地区或寄主来源的分离物优先相聚成簇，表现出较强的地理和寄主特异性。

3  讨论

本研究应用小RNA测序技术，从6个疑似病毒侵染样品的混合cDNA文库中检测到CMV和TeMV两种病毒，进一步应用RT-PCR进行了验证。CMV是雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）的典型成员。紫果西番莲（Passiflora edulis）被CMV侵染后，嫩叶上有明显黄点或黄斑，顶部新抽出嫩叶卷曲;老叶有褪绿及黄化现象。病株矮化，花、果明显减少。黄果西番莲（Passiflora edulis f. flavicarpa）受侵染也呈典型花叶，老叶上有黄化斑点，但病株无明显矮化现象[16]。TeMV是马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus，PVY）成员之一，侵染西番莲引起花叶、叶片皱褶和畸形[17]。这两种病毒侵染西番莲在贵州省均为首次报道。

按照国际病毒分类委员会关于马铃薯Y病毒的划分标准，即CP基因氨基酸序列一致性低于80%;CP基因或整个基因组的核苷酸序列一致性低于76%[18]。本研究测定的TeMV-GZ1和TeMV-GZ2分离物CP基因氨基酸、核苷酸序列与已报道的TeMV分离物一致性最高分别为99.3%、98.3%和98.2%、96.7%，高于80%、76%标准，与马铃薯Y病毒的划分标准相符。因此，TeMV-GZ1和TeMV-GZ2是TeMV的两个分离物。CMV-GZ的CP基因序列与已报道的其他分离物的一致性为82.3%～95.9%，介于张璇等[19]报道的77.1%～100.0%之间，由此可以确定CMV-GZ是CMV的一个分离物。根据寄主范围、致病性、血清性分析和CP核酸序列分析等，CMV株系或分离物可分为亚组I、亚组II[20]以及两者的重组型[21]，其中亚组I进一步分为亚组IA和亚组IB。CMV-GZ的CP基因及其氨基酸序列与侵染胡椒的CMV分离物FT（KU255786）CP基因的核苷酸和氨基酸序列一致性分别为97.1%和100%，CMV-GZ可能与FT同属于亚组IB[22]。RT-PCR验证结果表明，6份样品中均存在两种病毒，且样品ZF、ZN、WM、LD和CJ同时含有TeMV-GZ1和TeMV-GZ2分离物。

综合文献报道和NCBI数据库中登录的病毒序列信息来看，侵染西番莲的CMV主要分布于澳大利亚、美国、南非、巴西、厄瓜多尔、意大利、中国和韩国[5， 16， 23]，系统进化分析结果显示，意大利分离物单独聚为一支，巴西、厄瓜多尔、中国和韩国分离物聚为一支。侵染西番莲的TeMV仅在泰国和中国有报道，而TeMV的其他自然寄主植物广藿香（Pogostemon cablin）和夜来香（Telosma cordata）主要分布于越南、印度尼西亚等南亚国家。侵染西番莲的CMV分布更为广泛，遍布全球西番莲主产区;TeMV可能源于南亚地区，通过引种或其他途径传播到中国。系统发育分析结果显示，西番莲TeMV的贵州分离物TeMV-GZ1、TeMV-GZ2与广西分离物GX1的遗传距离最小，其次是泰国分离物Pangda12和Pangda15。相同地区或寄主来源的分离物优先相聚成簇，表现出较强的地理和寄主特异性，这与谢丽雪等[6]的研究结果较为一致，该病毒的适应性进化可能同时受地域和寄主植物驱动。

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