DNA条形码在本溪洋湖沟水生昆虫鉴定中的应用

于丹 王剑峰 刘玉双 王京

摘要 [目的]通过调查本溪市洋湖沟水生昆虫的种类，评价洋湖沟地区太子河源头的水质情况。[方法]2017年7月对洋湖沟水生昆虫进行了采集，基于EPT丰富度、采用DNA条形码及形态学特征对洋湖沟所采水生昆虫进行鉴定。[结果]共得到11个种14条样品序列，其隶属于3目11科：蜉蝣目3种，襀翅目4种，毛翅目4种。[结论]鉴定结果显示，洋湖沟地区EPT水生昆虫种类较多，水质清洁，达到国家I类标准。

关键词 洋湖沟;水生昆虫;EPT;DNA条形码;水质

中图分类号 S186文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）11-0056-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.11.018

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract [Objective]In order to investigate the species of aquatic insects in Yanghugou， Benxi， evaluate the water quality of the source of the Taizi River in Yanghugou area. [Method]Aquatic insects of Yanghugou were collected in July 2017. Based on the EPT richness， DNA barcode method and morphological features， the aquatic insects collected in Yanghugou were identified. [Result]A total of 14 sequences were obtained， totaling 11 species， belonging to 3 orders and 11 families. Among them， there are 3 species of the Ephemeroptera; 4 species of the Plecoptera; and 4 species of the Trichoptera. [Conclusion]The identification results show that there are many aquatic insects in the Yanghugou area， and the water quality is clean. It has reached the national class I standard.

Key words Yanghugou;Aquatic insects;EPT;DNA barcode;Water quality

基金項目 国家自然科学基金项目（31672332）;辽宁省自然科学基金项目（201602525）。

作者简介 于丹（1995—），女，辽宁锦州人，硕士研究生，研究方向：昆虫DNA分类。*通信作者，副教授，博士，从事昆虫分子系统学与形态学研究。

鸣谢 感谢扬州大学霍庆波博士对襀翅目昆虫鉴定提供的帮助。

收稿日期 2019-03-22

洋湖沟村位于辽宁省本溪满族自治县与桓仁县交汇处，属长白山余脉的丘陵地带，太子河发源于此地，流经辽阳、鞍山市[1]。洋湖沟村森林植被茂密，物种丰富，至今还保存着原始次生林，作为源头水，其地表水质应该达到国家I类标准[2]。

生物评价方法已经成为评价水体质量的一个新方向，对水体环境质量进行评价的主要方法有指示生物、各种生物指数和多样性指数[3]，可用于水质监测的水生昆虫指示生物有100多种，其中应用较为广泛的是分析鉴定底栖动物中3个敏感性的水生昆虫类群种类，即蜉蝣目（Ephemeriptera）、襀翅目（Plecoptera）和毛翅目（Trichoptera）的种类（简称EPT）及数量情况，利用EPT丰富度可快速评价水质优劣[4]。

三种EPT昆虫的成虫和稚虫在形态学存在较大差异，准确快速的鉴定存在较大困难。DNA条形码技术自2003年提出以来[5-6]，已被广泛应用于昆虫的分子鉴定[7-8]。因此，此次调查旨在结合DNA条形码和形态学特征，鉴别洋湖沟村太子河源头水域中EPT水生昆虫种类丰富度，从而评价洋湖沟地区的水质情况[1]。

1 材料与方法

1.1 材料

水生昆虫样品，2017年7月采集于辽宁省本溪县洋湖沟村太子河支流，采用手抄网的方法进行采集，标本于80%乙醇中保存。

1.2 DNA提取、PCR扩增与测序

根据虫体大小的不同，采用无损伤冻融法与粉碎法2种方法进行虫体总DNA的提取。虫体大于2 cm采用组织粉碎法（一只足）提取;虫体小于2 cm的采用无损伤冻融法提取。选取DNA条形码引物：LCO1490（5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′）和HCO2198（5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′）[9]。30 μL反应体系：ddH2O 21.25 μL，10 ×Taq Buffer 300 μL，dNTP 2.40 μL，上、下游引物各0.60 μL，Taq DNA Polymerase 0.15 μL（5 U/L），DNA模板2.00 μL。反应条件：预变性94 ℃ 4 min;变性94 ℃ 30 s，退火40～45 ℃ 1min，延伸72 ℃ 1 min，进行40个循环;终延伸72 ℃ 7 min;最终保存于4 ℃。取5 μL PCR产物，采用1% 琼脂糖胶电泳检验扩增效果。将得到的PCR产物送至上海生工测序公司，自带引物进行纯化和双向测序。

1.3 测序结果的分析

用Chromas软件观看测序结果是否可用;用Seqman软件对双向测序结果进行拼接，用Mega 7.0软件进行切齐。将切齐后的序列保存成一个TXT文本，采用 ClustalX 1.83软件对基因序列进行比对分析。将其比对结果转换成Mega格式，最后用Mega 7.0软件，基于K2P（Kimura-2-Parameter）模型，构建近邻结合树（Neighbour-Joining Tree，NJ树）[10]。

1.4 形态拍照

水生昆虫标本拍照采用Leica M205C体视显微镜。

1.5 物种鉴别

1.5.1

DNA数据库比对：将拼接得到的碱基序列在NCBI（National Center for Biotechnology Information）、EMBL（The European Molecular Biology Laboratory）、DDBJ（DNA Data Bank of Japan）、Bold systems V4数据库上进行比对，初步确定物种名称。

1.5.1

形态学鉴定。经DNA数据库初步比对，同时结合形态学鉴别[11-18]，确定昆虫种类。

2 结果与分析

2.1 測序结果

共提取水生昆虫30头（包含相同种），经分子试验，有部分样品DNA提取及PCR未成功，共送样测序14个样品，得到14条序列，11个种。有12条序列长度为658 bp，其余2条为657、659 bp。

2.2 基于COI序列构建的NJ树

测序结果经过Blast比对、构建近邻结合树（NJ树）如图1，相似度较高即亲缘关系较近的种聚在一起，证明鉴定结果的准确性。

2.3 物种鉴别

所得序列经比对，有些种类比对结果相似度较低，比对结果及相似度等信息见表1，并结合形态鉴定，共得水生昆虫11种，其中蜉蝣目3种，襀翅目4种，毛翅目4种，见图2～13。

3 结论

此研究结合DNA条形码和形态学方法，对洋湖沟所采集的水生昆虫进行鉴别并统计，共得到EPT昆虫11种，其隶属于3目11科：其中蜉蝣目3种，襀翅目4种，毛翅目有4种。EPT昆虫为敏感性水生昆虫，考虑到采集地区、采集季节及不同地区分类标准不同等因素，依据EPT种类丰富度评价水质标准[19-21]，可以得出辽宁省洋湖沟村太子河源头水质清洁，达到国家I类标准。

参考文献

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