鸡源大肠杆菌中QRDR基因的检测

冯涛 何纪元 薛原

摘要 为分析鸡源大肠杆菌对喹诺酮类药物的耐药机制，使用PCR技术从对喹诺酮类药物具有耐药性的大肠杆菌中扩增出喹诺酮耐药决定区（QRDR）基因。通过对所测序列结果的分析，得到DNA促旋酶和拓扑异构酶Ⅳ基因（gyrA、gyrB、parC、parE）的突变位点及其氨基酸的表达情况。根据基因型研究QRDR的流行病学情况，可指导喹诺酮类药物的临床合理用药。

关键词 大肠杆菌;gyrA基因;gyrB基因;parC基因;parE基因

中图分类号 S852.61文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）11-0106-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.11.029

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract In order to analyze the drugs resistance mechanism of fluoroquinolone to Escherichia coli from chicken，PCR technology was used to amplify determining area （QRDR）  gene in E.coli with drugs resistance of E.coli. According to sequencing results of obtained sequences， the mutation sites and amino acid expression of DNA gyrase and topoisomerase Ⅳ genes （gyrA，gyrB，parC，parE） were determined.  The study on the  epidemic situation of QRDR according to the genotype could guide the rational drug use in the clinic .

Key words Escherichia coli;gyrA gene;gyrB gene;parC gene;parE gene

基金项目 国家自然科学基金项目（31502119）;黑龙江省博士后科研启动金资助项目（LBH-Q14002）。

作者简介 冯涛（1996—），女，河北承德人，硕士研究生，研究方向：细菌耐药性研究。*通信作者，副教授，博士，硕士生导师，从事细菌耐药性研究。

收稿日期 2018-12-24

喹诺酮类药物在兽医临床上的应用有近 30 年的历史，是一类作用强、抗菌谱广的化学合成抗菌药[1]。但这类药物的使用频率日益深化，大肠杆菌对这类药物的影响程度越来越高[2]。被gyrA和gyrB 基因编码的DNA 促旋酶和被parC 和parE基因编码的拓扑异构酶Ⅳ是喹诺酮类药物产生耐药机制的主要作用区域[3]。在大肠杆菌中，gyrA 基因所表达的第67～106位氨基酸在报道中经常有突变的情况产生，而这种突变会导致大肠杆菌对喹诺酮类药物耐药或者使该菌株敏感性降低，即为喹诺酮的耐药决定区[4]。

笔者采用聚合酶链式反应（PCR）分离的大肠杆菌进行了喹诺酮类耐药基因突变的检测，了解东北地区鸡源大肠杆菌对喹诺酮类抗生素的耐药情况，以期为指导该类抗菌药物的临床合理应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株。大肠杆菌质控菌株ATCC25922由中国兽医药品监察所提供，试验菌株为采自东北三省不同地区的多个鸡源养殖场413株大肠杆菌。

1.1.2 主要仪器和试剂。DNA 片段凝胶回收和质粒小量提取试剂盒（爱思进生物技术有限责任公司）;DL2000 DNA Marker和Taq酶购自大连宝生物工程有限公司;DYY-6型电泳仪（北京市六一仪器厂）;凝胶成像分析系统（美国Alpha Imager2200公司）;YEAR2000 PCR仪（德国Biometra公司）。

1.2 方法

1.2.1 PCR扩增。参考文献[5-7]得到相应的引物序列，将序列送至哈尔滨博士生物有限公司合成QRDR基因的引物序列，利用合成的引物序列对413株大肠杆菌样本进行PCR扩增，并对所扩增得到的PCR产物进行电泳验证。

1.2.2 目的片段测序分析。以QRDR基因4种不同引物扩增所得的PCR产物扩增样本用胶回收纯化后与18-T载体连接，并转入到感受态细胞E.coli DH5α中克隆复制，将质粒样本送至哈尔滨博仕生物技术有限公司测序部进行序列测定。将返回的核苷酸序列利用DNAStar软件分析，与GenBank数据库进行序列比对，得出其序列的突变位点和特征。

2 结果与分析

2.1 gyrA、gyrB、parC、parE基因的检测结果

在413株鸡源大肠杆菌中，gyrA基因被检出呈阳性的有107株，阳性率为25.91%;gyrB基因的阳性菌株有219株，检出率为5303%;parC基因被检出呈阳性的菌株有201株，parE基因被检出呈阳性的菌株有263株，阳性率分别为48.67% 和6368%（图1～4）。

2.2 gyrA、gyrB、parC、parE基因的氨基酸序列分析结果

菌株的gyrA基因存在堿基发生突变的现象，导致gyrA基因所表达的氨基酸发生取代现象。主要包括

Leu55→Pro、Ser83→Leu、Asp87→Gly、Phe109→Leu和Ala136→Val，其中18K、26K、d31 3株有双位点氨基酸取代的情况出现。15个菌株中有7个菌株都发生Ser83→Leu突变，d31菌株表达为83位和87位的热点突变同时出现。菌株f14和f53 gyrB基因的碱基有突变发生，主要表现为Pro404→Ser、Leu451→Pro和Cys410→Tyr。耐药菌株S44、S49、S67、S82、22K、29K的parC基因碱基发生突变如Ser58→Ile、Gln62→Lys、Val122→Ala、Thr147→Ala和Val284→Met，这些氨基酸的改变也会使大肠杆菌降低其对药物的敏感性。 菌株16R发生Gln363→Arg突变，导致parE亚基发生氨基酸取代。

3 讨论

近年来，人类和动物分离的大肠杆菌对喹诺酮类药物耐药的菌株迅速增多[2]。构成DNA促旋酶和拓扑异构酶Ⅳ的氨基酸发生突变，影响了这2种酶的表达，导致大肠杆菌对喹诺酮类药物的结合能力发生了变化，从而导致耐药性的产生[3]。国内外研究表明，喹诺酮类药物的高水平耐药已经成为一个日益严重的问题[3]。该研究结果表明，多个基因突变位点在菌株中同时存在，高水平耐药也是由于多个位点的同时突变所产生的，这与刘晓强[8]的研究结果相似。该试验对PCR扩增产物进行测序，并且对测序结果进行比对分析，得到部分基因突变，从而使其表达的氨基酸发生突变。该试验对4种喹诺酮类药物进行耐药性研究，发现鸡源大肠杆菌对喹诺酮类药物的耐药性均偏高，说明这些突变的产生提高了细菌的耐药水平。

该研究中鸡源大肠杆菌的gyrA基因检测出Ser83→Leu、Asp87→Gly;gyrB基因发生Pro404→Ser、Cys410→Tyr、Leu451→Pro突变;parC基因发生Ser58→Ile、Gln62→Lys、Val122→Ala、Thr147→Ala和Val284→Met突变;parE基因发生Gln363→Arg突变。据报道[1-7]，gyrA基因表达的氨基酸易发生突变的最普遍位点为第81～87位，表现为发生一个或者几个氨基酸被另一种取代，而大肠杆菌对喹诺酮类药物表现出高度耐药，其主要原因就有第83位的丝氨酸经常被亮氨酸所取代。gyrB基因编码的氨基酸的突变则主要表现在第 426 和第 447 位上，其中第426位突变常可呈现为大肠杆菌对喹诺酮类药物均可以有耐药情况产生，而第447位突变表现为对萘啶酸的耐药性较为增强[1]。在近几年分离的大肠杆菌耐药菌株中，gyrA基因热点突变的概率会比gyrB基因突变的概率大得多[9]。目前研究表明，parC和parE基因发生不同位点的突变，会使细菌的耐药水平显著提高。但是，只有当表达促旋酶的基因发生的位点突变会产生对喹诺酮类药物耐药时，才会有parC和parE的位点突变产生。以上突变结果中，gyrA的热点突变Ser83→Leu和Asp87→Gly与任艳娜等[1]的研究结果相一致。

另外，非特异性耐药机制在较复杂的多重耐药中同样具有十分重要的作用，不仅对喹诺酮类药物的耐药有影响，而且对其他不同种类的抗生素均会产生耐药的情况，但这种耐药机制是否会对大肠杆菌和喹诺酮类药物的耐药水平有影响还需要进一步研究。喹诺酮药物是一种经过人工设计合成的化学抗生素，若要防止其耐药性的传播范围和频率以及耐药水平的不断增强，可以优先考虑人为改变其药物结构，从而减少DNA 促旋酶和拓扑异构酶Ⅳ的基因突变对耐药性的影响。

参考文献

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