黄皮叶绿体基因组测序与分析

赵志常 高爱平 黄建峰 罗睿雄

摘要 [目的] 分析黄皮[Clausena lansium （Lour.）Skeels）]叶绿体基因组，为黄皮属不同种或品种的进化、杂交、演变，以及黄皮不同品种的鉴定等提供技术支持。[方法]使用试剂盒提取了黄皮的叶绿体DNA，通过测序、组装、注释获得了黄皮叶绿体基因组。[结果]黄皮叶绿体基因组全长159 283 bp，其中反相重复序列区（IRs）长53 998 bp，大单拷贝序列区（LSC）和小单拷贝序列区（SSC）长度分别为87 301、 17 983 bp，共注释126个基因，包括编码蛋白基因89个，tRNA基因29个和rRNA 基因8个。黄皮叶绿体基因组全序列GC含量387%。对5种芸香科果树的全长序列、SSC、LSC、 IRA、 IRB进行比较分析发现，假黄皮的叶绿体全长序列、LSC、IRA 、IRB区域的长度较其他4种果树长，柠檬的SSC区域长度最长，黃皮的全长序列和SSC区域长度最短。黄皮叶绿体的基因数目和编码蛋白数目较其他4种果树多。对20种园艺植物的叶绿体基因组进行分析发现，同一科下面的不同属植物或同一属下面的不同种更容易聚为一类。[结论]该研究丰富了热带果树的叶绿体基因组数据库，为种质资源的合理开发利用提供了依据。

关键词 黄皮;叶绿体基因组;测序与分析

中图分类号 S667.9文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）11-0115-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.11.032

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract [Objective] The analysis of the chloroplast genome of Clausena lansium （Lour.）Skeels provides technical support for the evolution， hybridization and evolution of different species or varieties of Clausena lansium， as well as the identification of different varieties of Clausena lansium.[Method] The chloroplast DNA was extracted from Clausena lansium by kit， and chloroplast genome was obtained by sequencing， assembly and annotation. [Result] The chloroplast genome is 159 283 bp in length， of which the inverted repeats sequence （IRs） is 53 998 bp， the large singlecopy region（LSC） and the small single copy region （SSC） are 87 301 and 17 983 bp， respectively. A total of 126 genes are annotated， including 89 coding protein genes， 29 tRNA genes and 8 rRNA genes.The fullsequence GC content of the chloroplast genome was 38.7%. The fulllength sequences， SSC， LSC， IRA and IRB of five Rutaceae fruit trees， were compared and analyzed. It was found that the chloroplast fulllength sequences， LSC， IRA and IRB regions of Clausena excavata were longer than those of the other four fruit trees， and the Citrus limon in SSC region was the longest and the Clausena lansium  was the shortest.And the whole length sequence of Clausena lansium  is also the shortest among the five species.The number of genes and coding proteins of chloroplasts in Clausena lansium  was more than that in other four fruit trees. Analysis of the chloroplast genomes of 20 horticultural plants revealed that different genus plants under the same family or different species under the same genus were more likely to be clustered into one group.[Conclusion]This study enriched the chloroplast genome database of tropical fruit trees and provided a basis for the rational development and utilization of germplasm resources.

Key words Clausena lansium （Lour.）Skeels;Chloroplast genome;Sequencing and analysis

基金项目 国家自然科学基金资助项目（31471850）;国家重点研发计划（2018YFD1000500）;非营利性科研机构改革启动经费（1630032017005;1630032017004）。

作者简介 赵志常（1977—），男，山东烟台人，副研究员，从事热带果树遗传育种与分子生物学研究。*通信作者，研究员，从事果树资源学方面研究。

收稿日期 2019-01-14

叶绿体是光合作用的重要细胞器，探讨叶绿体各部分的功能以及在生物进化中的系统关系及作用，对研究作物改良、提高光合效率、探索细胞器的起源和进化具有重要意义。全面分析叶绿体基因组序列是做好这些工作的前提。叶绿体基因组研究不仅有助于通过遗传转化体系改良叶绿体功能，选育出有价值的新品种，而且可以在分子水平上揭示光合作用机理、核质互作关系以及物种起源与进化。1986年Shi-nozaki等[1]获得烟草叶绿体基因组全序列，开启了叶绿体基因组测序的先河。目前，叶绿体基因组数据库正在迅速充实，到2018年1月NCBI中已收集了来自不同植物的4 000多条叶绿体基因组全序列，以及一些果树植物的部分叶绿体基因组或某些基因的序列，其中包含同一个种的不同亚种和同一个种的不同栽培品种的叶绿体基因组全序列。叶绿体基因组非常保守，主要表现在基因组结构、基因排列顺序和基因种类等方面。在高等植物中，叶绿体DNA以共价、闭合、环形双链DNA的多拷贝形式存在，大小一般在120～160 kb，因此具有单亲遗传，小分子量、多拷贝、分子进化速率慢等特点[2-4]。叶绿体DNA序列已被广泛应用于分子系统发育研究中。该研究以黄皮叶绿体基因组原始测序数据结果为基础，进一步对黄皮叶绿体全基因组序列进行注释、校正，再将其与芸香科的4种植物叶绿体基因组进行比较，并对20种园艺植物的叶绿体基因序列进行聚类分析，以期对黄皮不同品种的鉴定以及种质资源的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 新鲜的黄皮叶片取中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所黄皮种质资源圃，-20 ℃冰箱保存备用。

1.2 研究方法

1.2.1 黄皮叶绿体基因组DNA 的提取与组装。利用天根公司的植物DNA提取试剂盒提取黄皮叶片的总DNA。 DNA 构建 300 bp 的文库，在 Illumina 测序平台，总测序深度约为 129X，测序得到约 39 G 的数据，对原始数据进行过滤低质量和PCR 复制等处理后，得到高质量的数据，使用 SOAPdenovo 软件对高质量数据进行组装，并以假黄皮的序列作为参考。采用OGDRAW软件（http：//ogdraw.mpimp-golm.mpg.de/）生成叶绿体基因组的物理图谱[5]。

1.2.2 叶绿体基因组的特征分析及系统进化分析。对照NCBI上已经登录甜橙（DQ864733）、假黄皮（NC_032685）、柠檬（KJ865401）、山小橘（KU949005）4种植物的叶绿体基因组序列，进行5种果树的叶绿体基因组的比较。根据NCBI上已经登录植物的叶绿体基因组序列共选取了20个主要园艺植物的叶绿体基因组序列，利用BioEdit软件对各物种的10 000个核苷酸序列利用近邻系统发育树分析[6-7]。

2 结果与分析

2.1 黄皮叶绿体全基因组结构及特征

结果表明，黄皮叶绿体基因组呈环状双链。与大多数高等植物叶绿体基因组一样，存在 2 个反向重复序列（Inverted repeat，IR），即 IRA 和 IRB;反向重复序列之间有一个大单拷贝区（Large single-copy region，LSC）和一个小单拷贝区（Small single-copy region，SSC）。黄皮叶绿体基因组全长159 283 bp，其中反相重复序列区（IRs）长53 998 bp，大单拷贝序列区（LSC）和小单拷贝序列区（SSC）长度分别为87 301、17 983 bp，共注释126个基因，包括编码蛋白基因89个，tRNA 基因29个和rRNA 基因8个（图1）。在全基因组中，A+T含量为61.4%、G+C含量为38.6%，在SSC中A+T含量为66.6%、G+C含量为33.4%，LSC中A+T含量为62.9%，G+C含量为37.1%，IRA中A+T含量为57.0%，G+C含量为43.0%，IRB中A+T含量为57.1%，G+C含量为42.9%（表1）。

47卷11期 赵志常等 黄皮叶绿体基因组测序与分析

2.2 5种芸香科叶绿体基因组比较

对NCBI上已经登录的假黄皮叶绿体基因组序列进行分析发现，其全长161 171 bp，反向重复区（IRA和IRB，27 411bp）、小单拷贝区（SSC，18 029 bp）、大单拷贝区（LSC，88 055 bp），其叶绿体基因组有113个基因、80个编码蛋白质基因、30个转运RNA基因和4个核糖体RNA基因。甜橙叶绿体全基因组长160 129 bp，大单拷贝区（LSC，87 744 bp）、小单拷贝区（SSC，18 393 bp）、反向重复区（IRA和IRB，26 991 bp），其叶绿体基因组有113个基因、79个编码蛋白质基因、30个转运RNA基因和4个核糖体RNA基因。柠檬叶绿体全基因组长159 893 bp，大单拷贝区（LSC，87 148 bp）、小单拷贝区（SSC，18 763 bp）、反向重复区（IRA和IRB，26 991 bp），其叶绿体基因组有115个基因、81个编码蛋白质基因、30个转运RNA基因和4个核糖体RNA基因。山小橘叶绿体全基因组长159 844 bp，大单拷贝区（LSC，87 494 bp）、小单拷贝区（SSC，18 332 bp）、反向重复区（IRA和IRB，27 009 bp），其叶绿体基因组有117个基因、83个编码蛋白质基因、30个转运RNA基因和4个核糖体RNA基因。对5种热带果树的全长序列、SSC、LSC、 IRA、 IRB进行比较分析发现，假黄皮的叶绿体全长序列、LSC、IRA、IRB区域的长度较其他4种果树长，SSC区柠檬的最长，黄皮的最短。并且黄皮的全长序列也是5种植物中最短的。黄皮叶绿体的基因数目和编码蛋白数目较其他4种果树多。作为芸香科的假黄皮和黃皮两者在tRNA和 rRNA的数目上均有差异。

[6] NEI M，KUMAR S.Molecular evolution and phylogenetics[M].Oxford，USA：Oxford University Press，2000.

[7] YANG Z H.PAML 4：Phylogenetic analysis by maximum likelihood [J].Mol Biol Evol，2007，24（8）：1586-1591.

[8] BAUSHER M G，SINGH N D，LEE S B，et al.The complete chloroplast genome sequence of Citrus sinensis （L.）Osbeck var ‘Ridge Pineapple：Organization and phylogenetic relationships to other angiosperms[J].BMC Plant Biology，2006，6：1-11.

[9] BAI L J，YE Y T，CHEN Q，et al.The complete chloroplast genome sequence of the white strawberry Fragaria pentaphylla[J].Conservation genetics resources，2017，9（4）：659-661.

[10] XIE H K，JIAO J，FAN X C，et al.The complete chloroplast genome sequence of Chinese wild grape Vitis amurensis（Vitaceae：Vitis L.）[J].Conservation genetics resources，2017，9（1）：43-46.

[11] PALMER J D，THOMPSON W F.Chloroplast DNA rearrangements are more frequent when a large inverted repeat sequence is lost[J].Cell，1982，29（2）：537-550.

[12] WANG R J，CHENG C L，CHANG C C，et al.Dynamics and evolution of the inverted repeatlarge single copy junctions in the chloroplast genomes of monocots [J].BMC Evolutionary Biology，2008，8（1）：36-51.

P80的同源性為97.3%。该试验结果表明，即使接种疫苗，仔猪依然存在PRRSV持续性感染状况。我国现有的商业化PRRSV弱毒疫苗能否有效预防HP-PRRSV，尚有待进一步研究。