甜瓜种子传带真菌初步研究

(中国农业大学植物保护学院， 北京 100193)

甜瓜(CucumismeloL.)属于葫芦科、甜瓜属，别名香瓜、甘瓜、哈密瓜，为一年生匍匐性或攀缘性草本植物[1]。甜瓜果实香甜可口，果肉含有丰富的水分、维生素和碳水化合物，可消暑清热、生津止渴；含有蛋白质、脂肪和无机盐等，能补充人体所需的能量和多种营养素；含有将不溶性蛋白质转化为可溶性蛋白质的转化酶，可有助于营养吸收；瓜蒂中的葫芦素B具有保护肝脏，减轻肝损伤，继而阻止肝细胞脂肪变性以及抑制纤维增生的功能；瓜籽中的蛋白质、纤维和粗油含量分别为25.2%、15.4%和37.8%[2]；瓜籽中有较高的赖氨酸，含硫氨基酸次之，还有大量的矿物质，特别是镁、钾和磷[3]。目前甜瓜在热带和温带地区广泛种植，其主要种植国为中国、美国、西班牙、土耳其和伊朗等。我国主要分布在新疆、甘肃、内蒙古等西北地区，20世纪80年代开始在华北、华中、华南及台湾地区种植[4]。据联合国粮农组织(FAO)统计，中国甜瓜的种植面积约为42.78万hm2，总产量达1 440万t(http://faostat3.fao.org/download/Q/QC/E)。近年来，保护地甜瓜连年种植，使其生长环境中病原菌大量积累，加上保护地内高温、高湿的生长环境，导致甜瓜病害发生日趋严重，制约了甜瓜产业的健康发展[4-5]。国外的一项研究表明，甜瓜等葫芦科作物种子共携带有8种真菌，分别是青霉菌、链格孢菌、镰刀菌、丝核菌(Rhizoctoniaspp.)、根霉(Rhizopusspp.)、炭疽菌(Colletotrichumspp.)、壳球孢菌(Macrophominaphaseolina)和黑曲霉(Aspergillusniger)[6]。而陈祥付等[7]报道，从5个甜瓜品种的种子上检测到镰刀菌、根霉和链格孢菌。本研究对来自10个省市的32个甜瓜品种的种子传带真菌情况进行检测，旨在初步明确其传带的主要真菌种类，从而为生产中甜瓜品种的选择及进行合适的种子处理提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试甜瓜品种

供试甜瓜品种共32个，其中金玉满堂、京蜜11号、蜜脆香园、京蜜10号、京蜜15号、京蜜8号、伊丽莎白、久久红、京蜜9号、YLJ一特金、京蜜7号、金碧辉煌、一特白、一特金2号、久青蜜、京玉2号等来自北京市；绿源来自河北省；青甜17号、绿香甜、和甜九号、春甜十三、绿麻瓜、黄金道、刀搂子、香香甜瓜等来自黑龙江省；绿宝石669来自辽宁省；吉祥红玉来自吉林省；绿萝来自陕西省；玉金香来自甘肃省；盛开花来自河南省；久红瑞来自安徽省；东方蜜一号来自上海市。

1.2 供试培养基

马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基[8]：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL。培养基在121 ℃高压蒸汽灭菌30 min后备用。

1.3 供试试剂

无菌水，1%次氯酸钠溶液。

1.4 种子携带真菌检测

参考Mathur等[9]的方法并稍加改进。具体操作步骤如下：

1) 每个甜瓜品种随机选取400粒种子。

2) 从400粒种子中随机选取40粒种子，将选取的种子均匀摆放在直径为9 cm的PDA平板上，每皿10粒，每个处理4次重复；然后置于25～28 ℃的培养箱中12 h黑暗/12 h光照条件下培养5 d后进行检查，记录干种子带菌种类并计算分离频率。

3) 将剩余的360粒甜瓜种子分别置于100 mL烧杯中，用30 mL无菌水充分洗涤后，吸取1 mL洗涤悬浮液放入1.5 mL离心管中，4 000 r·min-1离心15 min后弃上清液，再向离心管中加入500μL无菌水，充分振荡悬浮后吸取100μL均匀涂布于直径为9 cm的PDA平板上，每个处理4次重复。在相同的操作条件下空白对照为无菌水。然后置于25～28 ℃培养箱中12 h黑暗/12 h光照条件下培养5 d后进行检查，记录某类真菌菌落个数和菌落总数并计算分离比例。

4) 从 3) 无菌水洗涤后的甜瓜种子中每个品种随机选取40粒，晾干后将种子均匀放置在直径为9 cm的PDA平板上，10粒/皿，每个处理4次重复。然后置于25～28 ℃的培养箱中12 h黑暗/12 h光照条件下培养5 d后进行检查，记录水洗后种子带菌种类并计算分离频率。

5) 从 3) 无菌水洗涤后的甜瓜种子中每个品种随机选取100粒，在1% NaClO溶液中浸泡5 min后再用无菌水充分洗涤3遍，晾干后将种子均匀放置在直径为9 cm的PDA平板上，10粒/皿，每个处理4次重复。然后置于25～28 ℃培养箱中12 h黑暗/12 h光照条件下培养5 d后进行检查，记录1% NaClO处理后种子带菌种类并计算分离频率。

6) 将剩余的甜瓜种子随机选取40粒，使用钝头镊子等对种子进行种皮和种仁的分离。将处理后的完整种皮均匀放置在直径为9 cm的PDA平板上，每皿10粒，每个处理4次重复。然后置于25～28 ℃的培养箱中12 h黑暗/12 h光照条件下培养5 d后进行检查，记录种皮带菌种类并计算分离频率。

7) 将6) 中剥离的完整种仁均匀放置在直径为9 cm的PDA平板上，每皿10粒，每个处理4次重复。然后置于25～28 ℃的培养箱中12 h黑暗/12 h光照条件下培养5 d后进行检查，记录种仁带菌种类并计算分离频率。

1.5 种子携带真菌初步鉴定

将分离得到的真菌分别进行纯化、保存。根据真菌培养性状和形态特征，参考工具书进行初步鉴定[10-13]。

2 结果与分析

2.1 甜瓜干种子带菌检测结果

32个甜瓜品种的干种子带菌情况差异较大(详见表1)。绿源、京蜜11号、青甜17号、京蜜10号、绿香甜、和甜九号、春甜十三、盛开花、金碧辉煌、久久红和久红瑞等11个品种的干种子均未检测到真菌；金玉满堂和绿麻瓜等2个品种干种子带菌率高达100%；吉祥红玉、绿麻瓜、刀搂子和玉金香等4个品种干种子只检测到青霉菌；金玉满堂和黄金道等2个品种干种子检测到青霉菌和曲霉菌；久青蜜、京蜜8号和京蜜7号等3个品种干种子检测到镰刀菌；蜜脆香园、京蜜15号、YLJ一特金和京蜜9号等4个品种干种子检测到链格孢菌；绿宝石669、香香甜瓜、一特白、京玉2号和一特金2号等5个品种干种子检测到镰刀菌和链格孢菌。

表1 甜瓜干种子传带的真菌种类和分离频率

甜瓜品种 带菌率/%真菌种类和分离频率/%青霉菌曲霉菌镰刀菌链格孢菌其它金玉满堂100.010.090.0———绿宝石66940.025.0—12.56.356.3绿萝17.542.9———71.4蜜脆香园10.0———100.0—京蜜15号10.0———50.050.0吉祥红玉47.5100.0————久青蜜25.040.0—40.0—40.0绿麻瓜100.0100.0————黄金道70.092.925.0———刀搂子12.5100.0————香香甜瓜17.571.4—28.642.6100.0京蜜8号10.0——100.0——YLJ一特金90.05.6——11.183.3京蜜7号10.0——100.0——东方蜜一号50.0————100.0伊丽莎白60.025.016.7——58.3京蜜9号20.0———37.587.5一特白57.513.073.956.517.4—京玉2号62.556.012.044.044.024.0一特金2号80.025.0—12.562.5—玉金香40.0100.0————

注：“—”表示未检测到该种真菌。下同。

表2 水洗后甜瓜种子传带的真菌种类和分离频率

甜瓜品种 带菌率/%真菌种类和分离频率/%青霉菌曲霉菌镰刀菌链格孢菌其它金玉满堂100.090.0———10.0绿萝10.066.7—100.0100.0—京蜜15号75.0————100.0绿香甜16.7——40.0—60.0吉祥红玉20.083.3———50.0久青蜜15.0100.0————绿麻瓜50.0100.0100.0———黄金道33.360.050.0———刀搂子20.0100.0————YLJ一特金26.787.5——62.5—京蜜7号25.020.060.020.020.0—东方蜜一号30.025.0—25.050.0100.0伊丽莎白17.571.4100.028.642.971.4京蜜9号7.5——66.733.3—一特白35.050.0———75.0京玉2号12.5100.0———100.0一特金2号20.0——62.550.0100.0玉金香95.0——40.010.581.6

2.2 甜瓜种子洗涤悬浮液带菌检测结果

绿香甜、和甜九号、春甜十三、盛开花、YLJ一特金和伊丽莎白等6个品种的种子洗涤悬浮液中均检测到真菌。绿香甜、和甜九号、春甜十三和盛开花等4个品种种子洗涤悬浮液为青霉菌、曲霉菌以及链格孢菌，其中春甜十三的链格孢菌分离比例高达66.7%，和甜九号和盛开花的曲霉菌分离比例分别为13.3%和25.0%，和甜九号的青霉菌分离比例为86.7%；伊丽莎白种子洗涤悬浮液检测到青霉菌、曲霉菌和镰刀菌，其中镰刀菌的分离比例为25.0%；YLJ一特金种子洗涤悬浮液检测到青霉菌。其余甜瓜品种种子洗涤悬浮液均未检测到真菌。

2.3 水洗后甜瓜种子带菌检测结果

32个甜瓜品种的种子经过水洗后带菌检测结果为：绿源、京蜜11号、绿宝石669、青甜17号、蜜脆香园、京蜜10号、和甜九号、春甜十三、香香甜瓜、盛开花、京蜜8号、金碧辉煌、久久红和久红瑞等14个甜瓜品种的种子水洗后均未检测到真菌；金玉满堂种子带菌率高达100%；久青蜜和刀搂子种子水洗后只检测到青霉菌；绿麻瓜和黄金道种子水洗后检测到青霉菌和曲霉菌；绿香甜种子水洗后检测到镰刀菌；YLJ一特金种子水洗后检测到链格孢菌；绿萝、京蜜7号、东方蜜一号、伊丽莎白、京蜜9号、一特金2号和玉金香等7个品种的种子水洗后检测到镰刀菌和链格孢菌(表2)。

2.4 种子带菌检测结果

32个甜瓜品种的种子经过1%NaClO处理后的带菌检测结果为：绿源、金玉满堂、青甜17号、绿萝、蜜脆香园、京蜜10号、京蜜15号、和甜九号、春甜十三、吉祥红玉、久青蜜、绿麻瓜、刀搂子、香香甜瓜、盛开花、京蜜7号、东方蜜一号、伊丽莎白、金碧辉煌、京蜜9号、一特白、京玉2号、一特金2号、玉金香和久红瑞等25个甜瓜品种的种子均未检测到真菌；黄金道种子只检测到青霉菌；京蜜11号、绿宝石669、绿香甜、京蜜8号、久久红和YLJ一特金等6个品种的种子检测到镰刀菌或链格孢菌(表3)。

表4 1%NaClO处理后甜瓜种皮传带的真菌种类和分离频率

甜瓜品种 带菌率/%真菌种类和分离频率/%青霉菌镰刀菌链格孢菌其它绿源10.0100.0———金玉满堂22.544.4——77.8京蜜11号32.553.869.2——绿宝石66920.0—75.037.5—绿萝10.0100.0———京蜜10号10.0———100.0绿香甜10.0100.0——100.0绿麻瓜62.5100.0———盛开花10.0———100.0东方蜜一号10.0—100.0——伊丽莎白45.0———100.0京蜜9号20.050.0——50.0久红瑞62.5———100.0

表5 甜瓜种仁传带的真菌种类和分离频率

甜瓜品种 带菌率/%真菌种类和分离频率/%青霉菌曲霉菌镰刀菌链格孢菌其它绿源10.0100.0————金玉满堂15.0—83.3——66.7京蜜11号25.020.0—50.0—30.0绿宝石66910.025.0—100.0——绿萝12.560.0———80.0蜜脆香园10.0————100.0绿香甜40.037.5———100.0和甜九号20.0100.0————绿麻瓜90.0100.0————黄金道10.0100.025.0———刀搂子12.5——100.0—100.0京蜜7号30.0———50.050.0伊丽莎白100.0————100.0久红瑞90.0————100.0

表3 1% NaClO处理后甜瓜种子传带的真菌种类和分离频率

甜瓜品种 带菌率/%真菌种类和分离频率/%青霉菌镰刀菌链格孢菌其它京蜜11号30.0—75.0—50.0绿宝石66920.0——12.587.5绿香甜10.0—100.0——黄金道10.0100.0———京蜜8号10.0——100.0—YLJ一特金20.050.0—50.0—久久红10.0——100.0—

2.5 种皮带菌检测结果

32个甜瓜品种的种子经过1% NaClO处理后种皮带菌检测结果为：青甜17号、蜜脆香园、京蜜15号、和甜九号、春甜十三、吉祥红玉、久青蜜、黄金道、刀搂子、香香甜瓜、京蜜8号、YLJ一特金、京蜜7号、金碧辉煌、一特白、久久红、京玉2号、一特金2号和玉金香等19个甜瓜品种的种皮均未检测到真菌；绿源、金玉满堂、京蜜11号、绿萝、绿香甜、绿麻瓜和京蜜9号等7个品种的种皮检测到青霉菌；京蜜11号、绿宝石669和东方蜜一号等3个品种的种皮检测到镰刀菌，绿宝石669还检测到链格孢菌(表4)。

2.6 种仁带菌检测结果

32个甜瓜品种的种子种仁带菌检测结果为：青甜17号、京蜜10号、京蜜15号、春甜十三、吉祥红玉、久青蜜、香香甜瓜、盛开花、京蜜8号、YLJ一特金、东方蜜一号、金碧辉煌、京蜜9号、一特白、久久红、京玉2号、一特金2号和玉金香等18个甜瓜品种的种仁未检测到真菌；绿源、京蜜11号、绿宝石669、绿萝、绿香甜、和甜九号、绿麻瓜和黄金道等8个品种种仁检测到青霉菌；金玉满堂和黄金道等2个品种种仁检测到曲霉菌；京蜜11号、绿宝石669、刀搂子等3个品种种仁检测到镰刀菌；京蜜7号检测到链格孢菌(表5)。

3 结论与讨论

来自北京、河北、黑龙江、辽宁、吉林、陕西、甘肃、河南、安徽和上海等地的32个甜瓜品种的种子带菌情况检测结果为：干种子、种子洗涤悬浮液、水洗后种子、1% NaClO处理后种仁等均可检测到青霉菌、曲霉菌、镰刀菌和链格孢菌，但是不同品种之间的带菌情况差异较大。21个甜瓜品种的干种子上检测到真菌，其中金玉满堂和绿麻瓜的带菌率高达100%，绿宝石669、香香甜瓜、一特白、京玉2号和一特金2号的干种子检测到镰刀菌和链格孢菌；只有6个甜瓜品种的种子洗涤悬浮液中检测到真菌；水洗后，14个甜瓜品种的种子上未检测到真菌，但金玉满堂种子带菌率仍高达100%；经1% NaClO处理后只有7个甜瓜品种的种子上检测到真菌；经1% NaClO处理后，19个甜瓜品种的种皮上未检测到真菌，且所有甜瓜品种的种皮均未检测到曲霉菌；18个甜瓜品种的种仁未检测到真菌，京蜜11号、绿宝石669、刀搂子和京蜜7号的种仁中检测到镰刀菌或链格孢菌。本研究也从多个甜瓜品种上分离得到镰刀菌和链格孢菌，这与陈祥付等[7]的研究结果相似。

已有报道表明，尖孢镰刀菌甜瓜专化型(Fusariumoxysporumf. sp.melonis)引起甜瓜枯萎病[14]；再育镰刀菌(F.proliferatum)和木贼镰刀菌(F.equiseti)可引起甜瓜根茎腐[15]；腐皮镰刀菌(F.solani)可引起甜瓜根腐病[16]。镰刀菌可以在土壤中存活多年[17]，种子也可以传带镰刀菌[7]。此外，交链格孢(Alternariaalternata)引起甜瓜黑斑病[18]，瓜链格孢(A.cucumerina)引起甜瓜叶枯病[19]，西葫芦生链格孢(A.peponicola)引起甜瓜大斑病[20]。其中甜瓜黑斑病菌(A.alternata)和甜瓜叶枯病菌(A.cucumerina)以菌丝体或者分生孢子的形式在病残体上越冬，或者分生孢子附着在种子表面越冬[21-22]；甜瓜大斑病菌(A.peponicola)以菌丝体和分生孢子分别在病叶组织内外越冬，成为翌年初侵染源，种子是否带菌尚待研究[23]。本研究从甜瓜种子上分离得到的镰刀菌和链格孢菌种类还有待鉴定，且其对甜瓜是否有致病性、对甜瓜种子萌发是否有影响还需要进一步研究。