阿莫西林克拉维酸钾片仿制制剂与参比制剂杂质谱对比分析

王景欣，仇俊新，丁平田



阿莫西林克拉维酸钾片仿制制剂与参比制剂杂质谱对比分析

王景欣1,2，仇俊新2，丁平田1

（1. 沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳 110016；2. 华北制药股份有限公司，河北 石家庄 050010）

评价阿莫西林克拉维酸钾片仿制制剂与参比制剂杂质谱的一致性。方法通过对比分析《中华人民共和国药典》2015年版、《美国药典》41版、《英国药典》2018版收载的阿莫西林克拉维酸钾片有关物质的检测方法以及杂质限值，确定本品有关物质色谱条件并进行分析方法验证、优化杂质含量计算方法，对比分析仿制制剂与参比制剂杂质谱的一致性。结果本阿莫西林克拉维酸钾片有关物质检测方法专属性强、线性、耐用性等良好；优化后杂质含量计算方法更能真实地反映药品质量。结论本方法能够有效控制阿莫西林克拉维酸钾片的有关物质；仿制制剂与参比制剂杂质谱一致。

药剂学；阿莫西林克拉维酸钾片；高效液相色谱法；阿莫西林；克拉维酸；有关物质；杂质谱

阿莫西林克拉维酸钾片是国家基本药物，其中阿莫西林是-内酰胺类广谱抗生素，克拉维酸是一种不可逆型-内酰胺酶抑制剂，能够灭活-内酰胺酶，减少阿莫西林被-内酰胺酶的水解程度，增强阿莫西林对细菌的抑制作用，降低耐药性的发生[1-2]。2016年3月5日，国务院印发《关于开展仿制药质量和疗效一致性评价的意见》[3]，表明推进仿制药质量和疗效一致性评价的工作已提至国家战略高度。2016年5月25日，总局发布“关于落实《国务院办公厅关于开展仿制药质量和疗效一致性评价的意见》有关事项的公告”[4]明确规定到2018年底需要完成基药品种“阿莫西林克拉维酸钾片”质量和疗效的一致性评价工作。

当前仿制药一致性评价中，如何对仿制药的关键质量属性—有关物质进行评价，成为药学评价的关键。本课题组在对比分析国内外相关质量标准的基础上，确定本品有关物质色谱条件，参考相关文献[5-7]优化杂质含量计算方法，因为本品未检测出来源于克拉维酸的杂质，因此，将来源于阿莫西林的特定杂质，用阿莫西林标准品，外标法计算样品中杂质含量，能更加严谨地评价仿制制剂与参比制剂杂质谱的一致性。

1 仪器与材料

安捷伦Agilent1200高效液相色谱仪、Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）（安捷伦科技有限公司），BP211D电子天平（德国塞多利斯集团）。

阿莫西林对照品（含量质量分数为85.8%，批号130409-201011）、克拉维酸对照品（含量质量分数95.0%，批号130429-201307）、阿莫西林克拉维酸钾系统适用性对照品（批号130588- 201202）（中国食品药品检定研究院），阿莫西林克拉维酸钾片（自研，批号170201、170202、170203），阿莫西林克拉维酸钾片参比制剂（GSK，批号759181、794359、832706）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件的选择

《中华人民共和国药典》2015年版（ChP2015）、《美国药典》41版（USP41）、《英国药典》2018版（BP2018）均收载了阿莫西林克拉维酸钾片的质量标准。USP41版未对本品的有关物质进行检查和控制，对ChP2015年版和BP2018版阿莫西林克拉维酸钾片的有关物质检查方法的色谱条件进行对比，色谱图见图1、2。

1—Clavulanate; 2—Penicilloic acids of amoxicillin; 3—Amoxicillin; 4—Amoxicillin diketopiperazines; 5—Amoxicillin ring-closed dimer; 6—Amoxicillin ring-closed trimer

1—Amoxicillin; 2—Amoxicillin ring-closed dime

相同浓度的阿莫西林克拉维酸系统适用性对照溶液用ChP2015年版方法检出的杂质个数和分离度均优于BP2018版方法。因此，本试验方法采用ChP2015收载本品有关物质的色谱条件。

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm）；检测波长：230 nm；柱温：20 ℃；流速：1.0 mL∙min-1；进样体积：20 μL；流动相A：10 mmol∙L-1磷酸二氢钾溶液，用2 mol∙L-1氢氧化钠溶液调节pH值至6.0；流动相B：流动相A-乙腈（体积比20∶80）；洗脱方式：先以流动相A-流动相B（体积比98∶2）等度洗脱，待阿莫西林洗脱完毕后立即按表1进行线性梯度洗脱。

Table 1 Mobile phase gradient

2.2 溶液的制备

2.2.1 系统适用性溶液的制备

取阿莫西林克拉维酸系统适用性对照品适量，加流动相A溶解并稀释制成每1 mL中约含阿莫西林克拉维酸2.5 mg的溶液，作为系统适用性溶液

2.2.2 对照溶液的制备

精密量取对照品适量，用流动相A溶解并定量稀释制成每1 mL中含阿莫西林（按C16H19N3O5S计）40 µg的溶液，作为对照溶液。

2.2.3 供试溶液的制备

取本品细粉适量，加流动相A溶解并稀释制成每1 mL中约含阿莫西林（按C16H19N3O5S计）2 mg的溶液，滤过，取续滤液作为供试溶液。

2.3 专属性试验

取本品、空白辅料、阿莫西林空白辅料和克拉维酸空白辅料分别经酸、碱、高温、氧化和光照强制降解样品溶液各20 µL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，辅料空白和溶剂均不干扰两主峰及有关物质的测定；本品经酸、碱、氧化、高温和光照破坏后，两主峰与相邻杂质峰的分离度均符合要求，各杂质峰之间能够有效分离；两主峰峰纯度均符合要求；阿莫西林空白和克拉维酸空白降解产生的杂质均不干扰有关物质测定；破坏前后物料平衡。

2.4 检测限和定量限的确定

精密称取阿莫西林对照品，用流动相A溶解并逐步稀释，按“2.1”条色谱条件进行测定，阿莫西林最低检测限为0.125 μg∙L-1（/=3），最低定量限为0.416 μg∙L-1（/=10）。

精密称取克拉维酸对照品，用流动相A溶解并逐步稀释，按“2.1”条色谱条件进行测定，克拉维酸最低检测限为84 ng∙L-1（/=3），最低定量限为0.280 μg∙L-1（/=10）。

2.5 线性范围的确定

精密称取阿莫西林对照品适量，用流动相A溶解并稀释制成质量浓度约为0.9 g∙L-1的溶液，作为阿莫西林对照储备液；精密称取克拉维酸对照品适量，用流动相A溶解并稀释制成质量浓度约为0.4 g∙L-1的溶液，作为克拉维酸对照储备液。分别精密量取阿莫西林对照储备液和克拉维酸对照储备液适量，用流动相A稀释制成一系列质量浓度的阿莫西林和克拉维酸对照混合溶液，作为供试溶液。分别精密量取供试溶液20 µL注入液相色谱仪，以阿莫西林峰面积（）对质量浓度（）进行线性回归，得回归方程= 3.294 189 72×104+ 2 866.755 3，相关系数2= 1.000 0。结果表明，阿莫西林质量浓度在0.025～82.665 mg∙L-1内与峰面积呈良好线性关系；以克拉维酸峰面积（）对质量浓度（）进行线性回归，得回归方程= 2.006 629 61×104+ 1 102.031 0，相关系数2=1.000 0。结果表明，克拉维酸质量浓度在0.012～40.968 mg∙L-1内与峰面积呈良好线性关系。

2.6 溶液稳定性试验

精密称取阿莫西林细粉，加流动相A溶解并稀释制成每1 mL中约含阿莫西林2 mg的溶液，作为供试溶液；精密量取上述溶液适量，用流动相A定量稀释制成每1 mL中含阿莫西林40 μg的溶液，作为对照溶液。分别将供试溶液和对照溶液在25 ℃和4 ℃条件下放置，每隔一定时间后精密量取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，考察供试溶液中杂质的含量变化。结果表明，供试溶液在25 ℃放置1 h、4 ℃放置7 h，各已知杂质和总杂质含量的RD均小于10.0%，且没有出现新的杂质，说明供试溶液在25 ℃放置1 h、4 ℃放置7 h内稳定。

2.7 耐用性试验

分别考察“2.1”条色谱条件波长±2 nm、柱温变化±2 ℃、流速变化±20%、流动相pH值变化±0.2和流动相比例乙腈±10%时，仪器色谱行为的变化。结果表明，波长±2 nm、柱温±2 ℃、流速±20%、流动相pH值±0.2及流动相比例乙腈±10%时，阿莫西林克拉维酸系统适用性对照溶液的色谱图均与标准图谱一致，供试溶液中含量大于0.1%的杂质测得结果的RSD均小于10.0%，含量小于0.1%的杂质测得含量的绝对值均小于0.05%，方法的耐用性好。

2.8 杂质限度制定

2.8 .1 杂质的定量方法

ChP2015年版[8]和BP2018版[9]收载的本品质量标准中，杂质含量计算均采用不加校正因子的自身对照法，按对照溶液中阿莫西林和克拉维酸峰面积的和计算有关物质的含量。自研制剂和参比制剂0 d及加速试验6个月的有关物质检测结果表明，本品中检出的有关物质均为阿莫西林降解产生的杂质，与克拉维酸有关的克拉维酸聚合物及其他荧光杂质采用荧光分光光度法检测。为了真实准确的反映产品中有关物质的含量，将现行质量标准中按对照溶液中阿莫西林和克拉维酸峰面积的和计算，改为按阿莫西林的峰面积计算。

2.8.2 已知杂质的校正因子研究

根据阿莫西林和各杂质对照品线性方程的斜率计算各杂质的相对校正因子，结果见表2。

Table 2 Results of relative response factor of impurities

结果表明，阿莫西林噻唑酸、2’, 5’-二酮哌嗪-2（）阿莫西林和阿莫西林脱羧噻唑酸相对阿莫西林的校正因子均在0.9～1.1内，计算时无需校正。因此本品的有关物质定量方法采用不加校正因子的自身对照法，按对照溶液中阿莫西林的峰面积计算。

2.8.3 杂质控制限度的制定

ChP2015年版质量标准未规定特定杂质限度，按对照溶液中阿莫西林和克拉维酸峰面积的和计算，控制单个杂质≤2.5%，总杂质≤7.0%。换算成拟定质量标准的定量方法，按对照溶液中阿莫西林的峰面积计算，应控制单个杂质≤3.25%，总杂质≤9.1%。

BP2018版质量标准仅对阿莫西林二聚体作为特定杂质进行控制，其他均按未知单个杂质进行控制，按对照溶液中阿莫西林和克拉维酸峰面积的和计算，控制阿莫西林二聚体≤2.0%，未知单杂质≤1.0%。换算成拟定质量标准的定量方法，按对照溶液中阿莫西林的峰面积计算，应控制阿莫西林二聚体≤2.6%，未知单杂质≤1.3%。

参考ChP2015年版和BP2018版质量标准的杂质控制限度，并结合仿制制剂和参比制剂的稳定性考察结果，制定本品的杂质控制限度，拟定质量标准规定已知杂质阿莫西林噻唑酸、2’, 5’-二酮哌嗪-2（）阿莫西林、阿莫西林脱羧噻唑酸和杂质X的限度均≤1.0%，阿莫西林闭环二聚体≤2.0%，其他未知单个杂质≤1.0%，总杂质≤5.0%，控制限度均严于ChP2015年版和BP2018版标准。

2.9 样品测定

样品信息见表3。

采用本试验拟定的有关物质检测方法，分别对3批仿制制剂和3批参比制剂的有关物质进行检测，5个已知杂质及最大未知单杂质、总杂质均不高于参比制剂，试验数据见表4。

Table 3 Test sample information

Table 4 Related substance comparison result of self-developed product and reference product

3 讨论

采用优化后的本品有关物质控制方法，归属于阿莫西林的杂质含量计算结果要高于《中华人民共和国药典》2015版收载本品的控制方法，能更严谨地分析仿制制剂与参比制剂杂质的一致性。本试验方法和试验结果，对“阿莫西林克拉维酸钾片”仿制药一致性评价有一定的参考意义。

[1] 梁再赋. 国内阿莫西林/克拉维酸钾复方制剂的现状[J]. 国外医药: 抗生素分册, 2006, 27(2): 96.

[2] 于芳. 阿莫西林克拉维酸钾治疗婴幼儿急性上呼吸道感染的疗效及安全性评价[J]. 现代中西医结合杂志, 2015, 24(5): 528-529.

[3] 国务院办公厅. 关于开展仿制药质量和疗效一致性评价的意见(2016年第8号)[EB/OL]. (2016-03-05) [2019-03-05].http://www.gov.cn/zhengce/content/2016-03/05/content_5049364.htm.

[4] 国家食品药品监督管理总局. 关于落实《国务院办公厅关于开展仿制药质量和疗效一致性评价的意见》有关事项的公告（2016年第106号）[EB/OL]. (2016-05-26)[ 2019-03-05].http://samr.cfda.gov.cn/WS01/CL0087/ 154042.html.

[5] 胡昌勤. 2015年版《中国药典》有关抗生素的增修订及其质量控制方向[J]. 中国药学杂志, 2015, 50(20): 1764-1750.

[6] 缪文铃, 侯玉荣, 孙晶, 等. 阿莫西林克拉维酸钾片的杂质谱研究[J]. 中国药学杂志, 2017, 52(24): 2202-2208.

[7] 黄敏文, 袁耀佐, 张玟, 等. 国产阿莫西林克拉维酸钾片质量评价[J]. 药物分析杂志, 2012, 32(3): 520-526.

[8] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典: 二部[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2015: 435-436.

[9] British Pharmacopoeia Commission. British Pharmacopoeia[M]. [s.l.]: The Stationery Office, 2018: 399-401.

Comparative analysis of the impurity profiling consistency between amoxicillin and clavulanate potassium tablets and reference preparations

WANG Jingxin1,2，QIU Junxin2，DING Pingtian1

（1.,,110016,; 2..,050010,）

To evaluate the impurity profiling consistency between amoxicillin and clavulanate potassium tablets and reference preparations. MethodsThe HPLC conditions of related substance were determined by comparing analytical procedures and impurities limit recorded in ChP2015, USP41 and BP2018. Validation of analytical procedures and quantitation method optimization were performed. The impurity profiling of amoxicillin and clavulanate potassium tablets and reference preparations were compared with HPLC method determined above. Results Specificity, linearity, robustness and other validation characteristics of the established HPLC conditions of related substance were evaluated. The quality of preparation were reflected more truly by the optimized quantitation method of related substance. Conclusion The established analysis methods is suitable for controlling the related substances of amoxicillin and clavulanate potassium tablets. Impurity profiling of the generic preparations is consistent with reference preparations.

pharmaceutics; amoxicillin-clavulanate potassium tablet; HPLC; amoxicillin; clavulanate; related substances; impurity profiling

2019-03-05

王景欣(1976-),女(汉族), 河北石家庄人, 高级工程师,学士, 主要从事药剂学研究, Tel. 0311- 86674086 , E-mail 13930465920@139.com。

R94

A

（2019）04–0115–07

10.14146/j.cnki.cjp.2019.04.004

(本篇责任编辑：赵桂芝)