AQP4和rADC对低强度经颅超声治疗大鼠缺血后脑水肿的疗效评估

衣慧灵，杜娟,2，郑涛，胡硕，李嘉麒，石清磊，刘兰祥*

1.秦皇岛市第一医院核磁室，河北秦皇岛 066000；2.河北医科大学研究生学院，河北石家庄 050000；3.燕山大学，河北秦皇岛06600；4.秦皇岛市第一医院骨科，河北秦皇岛 066000；5.西门子有限公司磁共振产品事业部，北京 100000； *通讯作者 刘兰祥liulanxiang66@sina.com

卒中是一种常见的脑血管疾病，发病率高、致残率高、死亡率高。急性缺血性卒中占卒中的60%～80%[1-2]，是由于脑血管突然阻塞导致血液不能流入大脑而引起脑组织损伤的一种疾病。近年来很多研究者尝试用无创的物理方法如低强度经颅超声（low intensity pulsed transcranial ultrasound，LIPUS）刺激治疗缺血性卒中取得了较好的疗效，可能成为一种治疗脑血管病的新方法[3-4]，但是利用影像方法评价其治疗效果鲜有研究。有研究表明水通道蛋白 4（aquaporin 4，AQP4）的表达不同能反映LIPUS的治疗效果，相对表观扩散系数（relative apparent diffusion coefficient，rADC）的变化也能对LIPUS的治疗效果进行评价。因此，本研究利用高分辨扩散成像动态评价大鼠脑缺血损伤不同时间点给予超声刺激后，脑损伤区AQP4的表达情况及脑损伤区rADC的变化，从AQP4和影像方面评价LIPUS对超急性及急性脑梗死的治疗效果，并探讨 LIPUS减轻永久性大脑中动脉栓塞（distal middle cerebral artery occlusion，dMCAO）后脑水肿的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 雄性 SD 成年大鼠[购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：SCXK（京）2016-0006]40只，体重200～250 g，7周龄，分成4组，每组10只，建立dMCAO模型，对照组（A组）不给予超声刺激，实验组根据脑梗死分期分为超急性早期、超急性晚期和急性期，分别于模型后1 h、3 h、9 h给予超声刺激，分别记为B组、C组和D组。本研究经秦皇岛市第一医院伦理委员会批准。

1.2 动物模型制备 所有大鼠均用 3%戊巴比妥钠（5 mg/100 g）腹腔麻醉后进行手术，使用改良的Longa法制作大鼠永久性 dMCAO脑缺血模型，术前 12 h禁食不禁水。仰卧位固定后行颈部正中纵行切口；游离右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉并挂线标记；夹闭右侧颈总动脉，结扎颈外动脉近心端和远心端，中间剪断，于残端剪一小口，插入线栓，稍感阻力时停止进线，进线深度约18～19 mm；术中采用麻醉药维持剂量≤0.2 ml/（kg·h），电热毯加热保持大鼠体温在（38.0±0.5）℃。模型制作完毕后将大鼠头顶右侧皮毛剪开，暴露颅骨以便给予超声刺激。

1.3 超声刺激实验 采用一种商业经颅超声电疗仪（DK-102T，中国渡康医疗器械有限公司）给予大鼠超声刺激。非聚焦超声传感器的面积为3.5 cm2，总刺激持续时间为10 min。超声波的基本频率和脉冲重复频率分别为800 kHz和1 kHz。超声波持续时间和相互刺激间隔时间分别为10 ms和100 ms。超声波空间峰脉冲平均强度为1.2 W/cm2[5-6]。实验组分别于模型后1 h、3 h、9 h给予超声刺激。

1.4 MRI检查 采用Siemens 3.0T MR扫描仪，动物专用线圈，将各组大鼠麻醉后取俯卧位，头部置入线圈中央行冠状位扫描。扩散加权成像（DWI）序列扫描参数：TR 5000 ms，TE 70 ms，翻转角150°，层厚2.2 mm；体素1.0 mm×1.0 mm×2.2 mm，视野98 mm×98 mm，b值分别为 0、1000 s/mm2。TSE-T2WI序列扫描参数：TE 113 ms，TR 3530 ms，翻转角150°，层厚2.2 mm，体素0.3 mm×0.3 mm×2.2 mm，视野74 mm ×74 mm。

图像分析在后处理工作站上（德国西门子公司），感兴趣区（ROI）选择异常信号灶最大且包括两侧侧脑室的层面及对侧半球相应部位并测量其ADC值，由2名影像科医师分别进行测量，计算组内相关系数（ICC）>0.8，结果信度良好。为避免因梗死部位对实验结果产生的影响，计算时采用病变侧与正常侧的比值，即rADC值。ADC值=ln（S1-SO）/（bO-b1），其中S1为b=1000 s/mm2的信号强度，SO为b=0的信号强度，ln：自然对数；rADC值=ROI的ADC值/对侧ADC值×100%。ROI均为2 mm2。

1.5 病理学检查

1.5.1 TTC染色 MRI扫描后每组取2只，麻醉后断头取脑。把脑组织冷冻20 min后切成2 mm的冠状位切片，浸在2% TTC溶液中，放入37℃水浴箱中加热20 min，取出后放入10%多聚甲醛磷酸缓冲液固定24 h，固定后取出切片观察模型的脑缺血情况。

1.5.2 免疫组织化学染色 除去行 TTC染色的大鼠，其他均在麻醉后用4℃、4%多聚甲醛溶液灌流取脑，脑组织置于 4%多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋后做冠状切片。按照 Axiotis等[7]的方法进行染色分析，在显微镜下观察。在4组大鼠的右脑皮质中随机选取 20个视野，2名免疫学专家评估免疫组织化学染色强度百分比。用二甲苯和不同浓度的酒精常规脱蜡，用HE染色，每张切片随机选取4个高倍视野（×400）。

AQP4免疫组织化学染色半定量结果按阳性细胞百分比表达：0为 0～10%，1+为 11%～25%，2+为26%～50%，3+为51%～75%，4+为76%～100%。免疫染色强度半定量分析：1+为染色较弱，2+为适度染色，3+为染色较强。将这两种评分方法的结果相加，得到以下评分：0～2分为弱表达，3～5分为中度阳性表达，6～7分为强阳性表达。计算20个视野的平均值，并将结果四舍五入到最接近的整数。

1.6 统计学方法 采用SPSS 20.0软件，计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AQP4表达情况 A、B、C、D组的AQP4阳性细胞百分比分别为 87%、67%、65%、88%，评分分别为（7±2）分、（3±1）分、（4±2）分、（6±2）分。A组和D组阳性细胞百分比和平均分接近，AQP4具有较强的阳性表达。B组和 C组在 LIPUS治疗下AQP4阳性细胞百分比和平均分均降低。在脑缺血后1 h给予超声刺激治疗后AQP4阳性染色细胞密度降低最明显，A组平均染色分数在6～7分，B和C组的平均染色分数均在3～4分，D组平均染色分数在6～7分，表明AQP4在对照组及9 h超声治疗组的细胞中有较强的阳性表达（图1）。

图1 4组大鼠脑AQP4免疫组化染色结果（×400）。A组和D组见较强的AQP4表达，较B组和C组染色明显，阳性细胞数量多

2.2 AIS大鼠右侧大脑梗死区域rADC值及TTC染色结果 dMCAO建模后12 h，A组、B组、C组及D 组大鼠脑 rADC 值分别为 0.24±0.15、0.39±0.22、0.42±0.29及 0.23±0.18，B组、C组明显高于 A 组（P=0.016、0.018），D组与A组比较差异无统计学意义（P=0.850）。TTC染色结果显示，右侧大脑半球脑组织显示白色区域为梗死区。

图2 大鼠脑急性脑缺血MRI及TTC染色结果。A～C分别是冠状位T2WI、冠状位高分辨扩散成像、冠状位rADC MR图像，D为TTC染色结果。MRI图像表明右侧大脑中动脉栓塞后出现大面积急性脑梗死，TTC染色图与其对应

3 讨论

3.1 LIPUS对急性脑水肿的调控 脑水肿指脑组织中水分子的异常聚集，从而引发脑肿胀。肿瘤、创伤以及脑血管疾病等多种颅内病理变化均能导致脑水肿的发生，严重的脑水肿则可能导致脑疝，从而危及患者生命[8]。目前临床上仍然以甘露醇等药物作为缺血后脑水肿的首选治疗方法，但其效果受到血-脑屏障通透性和肝脏代谢的影响。LIPUS作为近十年内新的脑病治疗方法，已在脑肿瘤、癫痫、阿尔茨海默病和帕金森病等治疗中发挥了独特的作用[9-10]。既往研究将LIPUS用于创伤后脑水肿的调节，并取得了突出的疗效[11-12]。

LIPUS指用低强度超声穿透完整的大脑颅骨从而达到对脑血管和脑神经功能调制的一种技术，它具有无损伤、可调节、高刺激深度、高空间分辨率、无永久副作用等优点[13]。Guo等[14]研究证明LIPUS可调节大脑神经活动，提高脑血氧饱和度并增加脑血流量，降低脑组织脑缺血损伤。Li等[4]研究表明，在缺血性卒中发作后立即给予超声波刺激可促进血液供应，减小缺血面积。

3.2 rADC和AQP4联合评估LIPUS的疗效 DWI作为一种能够在疾病早期（6 h以内）甚至在超早期明确显示梗死区域的 MRI技术，是诊断急性缺血性卒中的“金标准”。采用rADC评价不同个体间的病变状态更具有可比性[15]。Copen等[16]通过研究脑梗死rADC的散点图和时程表对发病时间作出估计，发现rADC值是对脑梗死灶性质进行量化的一个指标，可以更客观地反映病灶的时程。Unruh等[17]报道AQP与脑水肿的发生密不可分。在哺乳动物脑中最主要的是AQP4，其与脑脊液的产生和重吸收有关，调控脑水肿发生极性，即在靠近血管内皮细胞的星形胶质细胞终足膜上出现大量表达，使脑水肿明显加重；下调APQ4则可以减轻脑水肿的程度，提示AQP4是胶质细胞与脑脊液及血管之间水转运和调节的重要结构基础，是脑水肿中重要的靶蛋白[18]。

本研究发现，在dMCAO后1 h、3 h给予LIPUS刺激，可使AQP4表达明显下调，rADC值增大。B组、C组APQ4免疫组化评分均低于A组，B组和C组APQ4免疫组化评分无显著差异。Manley等[19]进行的脑缺血损伤实验发现，剔除AQP4基因后的小鼠脑水肿形成程度较对照组明显减轻，小鼠的神经功能缺损程度也相应地减轻。Igarashi等[20]采用AQP4抑制剂 TGN-020预处理脑缺血小鼠模型，发现抑制脑缺血小鼠AQP4的表达可减轻缺血后脑水肿和脑梗死程度。推测LIPUS刺激可能引起脑组织的血管舒张，进而增强大脑受损区域的血流，抑制细胞毒性水肿减轻细胞肿胀，使细胞间隙的缩小有所改善，减缓rADC值下降，使AQP4表达下调，从而减轻脑水肿。LIPUS对超急性早、晚期脑缺血均有明显的治疗效果。dMCAO后9 h给予LIPUS刺激，AQP4表达及rADC值与对照组比较均无显著差异。分析随着缺血时间延长到9 h后，会出现胞膜破裂，细胞内细胞器等有形结构破坏，缺血区酸中毒，并导致不可逆的缺血性脑损伤[21-22]，因此 LIPUS对急性期脑缺血治疗效果不明显。

本研究发现，尽管dMCAO模型大鼠脑组织中AQP4表达可以反映 LIPUS治疗大鼠超急性期及急性期脑缺血后脑水肿的变化，但本研究对LIPUS影响 AQP4的机制尚不十分清晰，对 AQP4的极性表达未进行深入探讨。下一步将继续对AQP4蛋白进行更精细化的研究，为治疗脑缺血水肿提供新思路，为研发理想的脑缺血治疗方案提供新的靶标。