血清miR-31可用于非小细胞型肺癌诊断

刘日清，黄仁林，梁 柱

1廉江市人民医院心胸外科，广东 廉江 524400；2广东医科大学附属医院心胸外科，广东 湛江 524021

非小细胞型肺癌（NSCLC）只有约20%可以早期切除，然而在接受手术的患者中，大约50%复发，主要复发原因是远处转移[1]。NSCLC预后的主要影响因素是肿瘤的临床分期，但是既往研究发现，具有相同临床分期和其他临床特征的患者的预后存在显著差异，而通过将分子生物标志物的评估与传统癌症分期相结合可以改善NSCLC的管理[2]，miRNA转录后调节靶基因的翻译并影响一系列细胞功能如增殖、分化和凋亡。目前已有大量研究发现恶性肿瘤组织中miRNA表达发生明显改变，且与预后和治疗结果相关，miRNA能够提供比单独的单个标记物或基因表达谱的表达更准确的预后预测[2-3]。miRNA-31作为目前临床研究较少的一种微小RNA分子，在部分临床研究及动物实验中被发现作为一种致癌基因参与肺癌的发生发展，且通过针对特定肿瘤抑制因子进行抑制[4-5]。有研究在192例原发性结直肠癌标本中发现miR-31过表达可能参与原发性结直肠癌的发展和进展[6]。但截至目前，临床关于miRNA-31在NSCLC中的研究仍十分匮乏，且临床研究稀少。本研究关注于血清中miR-31的表达与NSCLC的关系，以期发现血清miR-31作为NSCLC新的分子标志物的临床价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择我院及广东医科大学附属医院2017年1月～2019年1月NSCLC患者42例。纳入标准：患者都经由病理确诊，符合美国国家综合癌症网络提出的《非小细胞肺癌指南》中的诊断及分期标准；术前未进行放疗、化疗等治疗措施；术前血常规、肝肾功能正常者。排除标准：合并其他肺部疾病如间质性肺炎；妊娠期或哺乳期患者。获得上述患者的肺癌组织标本和癌旁组织标本，并抽取该42例患者和40例对照健康人群的外周血。42名患者年龄68.5±4.6岁，男性24名，女性18名；36例患者有吸烟史，6例不吸烟；其中I期18例，II期15例，III期9例。本次研究经过我院医学伦理委员会审批后实施。

1.2 标本处理

规范收集新鲜切除手术标本，在离体后迅速放入冻存管，存入-80 ℃保存。术前1 d抽取外周血3～5 mL后置于EDTA抗凝管中，静置30 min，4 ℃下1500 r/min离心20 min，取上层清亮血清至RNAse-free EP管中，置于-80 ℃保存。

1.3 实验流程

1.3.1 总RNA的提取 肺癌组织和癌旁组织采取TRIzol试剂（Invitrogen公司）一步提取法，具体操作按照说明书进行。使用分光光度计测量RNA浓度和纯度，取1 μg总RNA，100 V电压下进行琼脂糖凝胶电泳30 min，观察RNA完整性。提取的总RNA分装在EP管中，-80 ℃下保存。

1.3.2 逆转录 参照miRNA反转录试剂盒说明书操作进行（试剂由锐博生物生产）。反应体系共15 μL（在7 μL逆转录混合液体系中加入5 μLRNA和3 μL逆转录引物）。反应条件为42 ℃转60 min，75 ℃i10 min。

1.3.3 RT-PCR 采用TaqMan探针法，按照试剂盒说明书操作（北京晶典生物）。反应体系包括cDNA 1 μL，2×PCR Master Mix 10 μL， Forward primer 1 μL，Reverse primer 1 μL，10×SYBER Green 0.5 μL，ddH2O 6.5 μL。反应条件为95 ℃反10 min，95 ℃i15 μL，60 ℃560 s，共40个循环。反应结束后读取Ct值。

1.4 统计学处理

miRNA相对表达量用2-△△Ct法计算，所有数据利用SPSS19.0软件处理，计数资料采用卡方检验，计量资料采用t检验或方差分析，ROC曲线分析miR-31对NSCLC的诊断效能。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR检测miR-31的结果

miR-31的扩增曲线呈S型，曲线平滑，溶解曲线为单峰，无杂峰信号，未出现非特异性扩增和污染（图1）。

图1 miR-31的PCR结果

2.2 miR-31在肺癌组织和癌旁组织中的表达

miRNA在NSCLC组织中表达水平的2-△△Ct值为5.46±4.19，在相应癌旁组织中为3.79±7.08。肺癌组织miR-31表达水平显著高于癌旁组织（P＜0.05）。

2.3 miR-31表达与NSCLC临床特征的相关性

单因素分析结果表明，miR-31在NSCLC组织中的表达水平与临床分期，是否淋巴结转移相关，与年龄、病理类型、病理分级无关（P＜0.05）。进一步多因素Logistic回归分析发现，临床分期和是否淋巴结转移是miR-31 表达水平的独立危险因素（表1、2）。

2.4 miR-31

在血清中的表达及组织和血清miR-31表达量的相关性miR-31在NSCLC患者中的血清表达水平为3.13±1.94，在正常人中的血清表达水平为1.23±2.28，NSCLC患者血清miR-31表达水平高于正常人（t=4.07，P=0.0001）。患者肺癌组织和血清中的miR-31的水平呈正相关（r=0.909，P=0.001，图2）。

表1 NSCLC组织中miR-31表达与临床特征的单因素分析（Mean±SD）

表2 NSCLC组织中miR-31表达与临床特征的多因素分析

图2 组织miR-31和血清miR-31表达水平的相关性

2.5 血清miR-31水平对NSCLC的诊断效能

图3 miR-31与NSCLC的ROC曲线

通过ROC曲线得知，当曲线下面积最大时，面积为0.803，此时敏感性为0.829，特异性为0.763（图3）。

3 讨论

microRNAs已被确立为在肺癌发展，上皮-间质转化和治疗反应等过程中具有相关作用的参与者[7-8]。在切除的肿瘤样本或细针抽吸样本中测量的miRNA已成为肿瘤诊断，预后和治疗反应预测的引人注目的生物标志物，因为它们易于检测并且极端特异性[9]。痰、血浆、血清或全血中存在的miRNA越来越多地被探索为用于早期检测癌症的侵入性较小的生物标志物[10-12]。miRNA31是一种进化上保守的miRNA[13]，位于人类染色体9q21.3上，并与CDKN2和IFNA家族的簇相邻，是多种人类癌症中基因组丢失的热点[14]。目前，miR-31已被发现在包括乳腺癌[15]、肺癌[16-17]、结直肠癌[18]和成人T细胞白血病[14]等多种癌症组织中表达异常。本研究结果发现，NSCLC组织miR-31显著高于癌旁组织，NSCLC患者血清miRNA水平显著高于正常人血清，表明miR-31参与NSCLC的发生发展。有研究也同样发现正常人体肺组织中miR-31中的3P、5P表达量均远低于肺腺癌组织中的miR-31中3P、5P表达量[19]，提示肺癌组织存在miR-31基因突变。有研究发现MET、PIK3C2A、GRB10等均为miR-31的直接靶基因[20]，miR-31一方面能通过抑制多种肿瘤转移相关基因抑制肿瘤转移过程，包括靶向抑制大肠癌中RASAl基因和乳腺癌中RhoA基因的表达；另一方面，miR-31作为致癌因子能通过抑制某些肿瘤抑制因子LATS2和PPP2R2A来抑制特定肺癌细胞的功能。但是，某个特定microRNA在肿瘤细胞中异常表达不一定会促进癌症的发生和扩增，miR-31在NSCLC组织中的异常高表达可能是肿瘤表型的多种机制的综合作用结果。研究结果显示，NSCLC临床分期、是否存在淋巴结转移是影响miR-31表达水平的独立性危险因素，miR-31诊断NSCLC的敏感性0.829，特异性0.763，表明miR-31参与NSCLC疾病的进展，且针对NSCLC有较高的临床诊断价值。

本项研究关注miR-31对NSCLC诊断的价值，希望能发现NSCLC新的分子标志物，提高诊断的准确性，为病人提供更精细化的疾病管理。研究发现miR-31在NSCLC中表达上升，血清miR-31可以作为较好的监测指标。但miR-31在肺癌的发生发展中发挥什么样的作用及其机制，仍需要更进一步的研究加以论证。

[20]侯春英.MET-PI3K-Akt信号通路介导miRNA--31调控肺腺癌肿瘤干细胞功能[D].北京： 北京协和医学院,2016.