七叶皂苷凝胶对宫颈炎大鼠的治疗作用

薛晓畅，成俊宏，郭红彬，王东方，张喜烨，袁晓峰，李志兰，王增禄，3

1西安交通大学//三八妇乐集团生物医药联合研究院，陕西 西安 710065；2西安蓝绿卓生物科技有限公司，陕西西安 710000；3空军（第四）军医大学药学系生物制药学教研室，陕西 西安 710032

七叶皂苷是由七叶树科植物七叶树的果实娑罗子中提取得到的总皂苷、β-七叶皂苷和异七叶皂苷等的总称[1]，主要含有七叶皂苷A、B、C和D 4种组份[2-3]。大量研究表明，七叶皂苷及其钠盐已在临床广泛用于脑水肿、创伤或手术所致肿胀、静脉回流障碍或烧伤等多种疾病的治疗[4-5]。宫颈管表层的单层柱状上皮本身抵抗感染的能力比较差，在受到各种机械性刺激时容易受损继而引发感染，导致急慢性宫颈炎[6-7]。过度清洁阴道导致的菌群失衡也会诱发宫颈炎[8-9]。急性宫颈炎主要表现为宫颈红肿、颈管黏膜水肿、常伴急性阴道炎或子宫内膜炎，慢性宫颈炎有宫颈糜烂（宫颈柱状上皮异位）、宫颈肥大、宫颈息肉、宫颈腺囊肿和宫颈外翻等多种表现[10-11]。急性宫颈炎治疗不及时会发展为慢性宫颈炎，其诱发的损伤会导致乳头瘤状病毒的感染病增加罹患宫颈癌的风险[12]。还有研究报道，宫颈炎可加剧HIV的传播，治疗宫颈炎后，艾滋病患者宫颈中的HIV病毒的RNA拷贝数显著降低[13]。因此，研发宫颈炎治疗药物具有重要的临床价值。

虽然关于七叶皂苷用于抑制炎症的研究有大量报道[14-17]，目前关于七叶皂苷用于宫颈炎治疗的研究国内外还鲜有涉及。研究者此前结合利用醇提和软性填料Q-Sepharose Fast Flow离子交换柱层析获得了七叶皂苷提取的新工艺，分离纯化的总七叶皂苷纯度达到90%以上，该产物制备成气雾剂/喷雾剂用于组织水肿模型大鼠的治疗，发现对于组织水肿有显著的疗效[18]。本研究将七叶皂苷制备成凝胶剂并应用于宫颈炎大鼠模型的治疗，结果表明该凝胶剂对模型大鼠具有明显的治疗效果，可以显著改善大鼠外阴红肿炎症、减轻组织水肿程度、减少阴道分泌物；HE染色结果表明损伤部位的炎性细胞浸润水平被显著抑制；表明使用该工艺制备的七叶皂苷有望用于宫颈炎的治疗。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠120只（重庆腾鑫生物技术有限公司），SPF级，体质量200 ± 20 g。

1.2 主要试剂和仪器

苯酚和阿拉伯树胶（Sigma），七叶皂苷（蓝绿卓生物科技有限公司制备），凝胶剂（陕西三八妇乐特医食品有限公司制备），卡波姆940（路博润公司），丁二醇（大赛璐公司），羟苯甲酯（晋盛大公化工有限公司），柠檬酸（潍坊英轩实业有限公司），L-精氨酸（协和发酵麒麟（中国）制药公司）。其他常规化学试剂购自西安红岩试剂厂。

1.3 方法

1.3.1 七叶皂苷凝胶剂制备 七叶皂苷按照此前方法进行制备和纯度鉴定[18]。然后按照下表的配方制备七叶皂苷凝胶剂（表1）。

表1 七叶皂苷凝胶剂配方

1.3.2 建立大鼠宫颈炎模型、实验分组 所有SD大白鼠予以标准饲料适应性喂养1周，然后随机分为4组：正常组、模型组、七叶皂苷钠凝胶剂高（2.5 mg/g）、低（0.5 mg/g）剂量组。取苯酚15.0 g、阿拉伯树胶20.0 g制成25%苯酚胶浆，利用此胶浆在SD大鼠中制备宫颈炎模型。具体方法为：首先用戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠，然后采用大鼠固定筒架将大鼠倒立固定好，将12号注射针头尖端剪去，磨平，使头部光滑，用处理过的注射针头轻轻插入大鼠阴道深处约2 cm处，注入25%苯酚胶浆0.25 mL，棉球固定阴道口，保持大鼠倒立状态5 min，给苯酚胶浆，2 d/次，共5次。造模过程中观察阴道变化，给予苯酚胶浆5次后大部分大鼠阴道口红肿，有脓性物流出。结果表明，出模率为100%且操作治疗过程中无动物死亡。

1.3.3 大鼠宫颈炎模型的治疗 造模成功隔日后，正常组和模型组大鼠给予正常饲养，治疗组将SD大鼠装入固定筒架，头部朝下，用处理过的注射针头轻轻插入大鼠阴道深处约2 cm处给予高剂量（2.5 mg/g）和低价量（0.5 mg/g）七叶皂苷钠凝胶剂0.25 mL进行治疗，不含七叶皂苷的凝胶基础方作为阴性对照。每日给药1次，并称量大鼠体质量并计算相对体质量变化（实验前后体质量变化情况）、阴道口红肿情况以及脓性分泌物流出量等。其中阴道口红肿评分标准：无（0分）、轻度（1分）、中度（2分）和重度（3分）；阴道口脓性分泌物评分标准：无（0分）、少量（1分）、中量（2分）和多量（3分）。给药10次后，迅速麻醉处死大鼠，进行取材观察。

1.3.4 组织取材、处理和切片染色 选取大鼠阴道至子宫分角处部分组织进行称重，考虑到大鼠个体间体质量差异的影响，计算组织相对重量（组织/体质量×200）衡量组织水肿情况。然后将取材组织在4%多聚甲醛中固定24 h，送西安交通大学附属一医院病理科进行常规的梯度酒精脱水、透明、浸蜡、包埋、切片（片厚5 μm），并进行HE染色和结果分析。

1.4 统计学处理

运用SPSS 18.0统计软件对数据进行统计学分析，各组数据以均数±标准差表示，组间比较采用双尾t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 苯酚胶浆可诱导大鼠宫颈炎模型

前期我们利用不同浓度的苯酚胶浆在SD大鼠中诱导宫颈炎模型，结果发现20%以下的苯酚胶浆出模率不高且大鼠症状不稳定，而25%苯酚胶浆则能够高效率地诱导出宫颈炎模型。经苯酚胶浆处理5次后，大鼠的阴道严重水肿且有脓性分泌物流出（图1）；解剖其阴道至宫颈段，发现组织明显红肿、质量显著增加（图2）。

图1 苯酚胶浆诱导宫颈炎模型大鼠阴道外观

图2 苯酚胶浆诱导宫颈炎模型阴道至宫颈组织形态变化

2.2 七叶皂苷凝胶对大鼠宫颈炎模型的治疗作用

将制备的七叶皂苷钠凝胶剂用于对大鼠宫颈炎模型进行了治疗，结果表明七叶皂苷钠凝胶剂在低剂量时即对模型大鼠具有一定的疗效，而高剂量组效果显著。与实验开始前体质量相比，模型组大鼠较正常组体质量明显减轻（P＜0.001，图3），而七叶皂苷钠高、低剂量治疗组均有明显改善（P＜0.001），与正常组相比无显著的体质量减轻，基础方治疗组体质量减轻略微缓解（P＜0.05）；通过称重并计算相对重量考察阴道至子宫部位的组织水肿情况，发现模型组重量增加（P=0.020），而七叶皂苷钠治疗组则与正常组差异无统计学意义（P＞0.05），其中高剂量组改善显著（P=0.016，图4）；对大鼠的阴道红肿和分泌物量进行评分，结果表明七叶皂苷钠可以显著逆转模型组出现的阴道红肿且分泌物明显减少，颜色也由模型组的淡黄色转为无色（图5）。

图3 七叶皂苷钠凝胶剂有效善宫颈炎模型大鼠的体质量减轻

图4 七叶皂苷钠凝胶剂明显减轻宫颈炎大鼠的组织水肿

为了进一步明确七叶皂苷钠的抑炎效果，给药10次后处死大鼠，取阴道至子宫部位组织进行多聚甲醛固定，石蜡包埋并组织切片。正常大鼠光镜下可见宫颈黏膜表被复层扁平上皮，根据周围不同，表面有或无角化，或有数层粘液样细胞，上皮下为致密结缔组织，可见少量小血管；阴道组织光镜下组织结构与宫颈基本相同，与性周期有关的形态学改变不明显（图6A）。模型组大鼠宫颈组织表现为粘膜下充血和大量炎性细胞浸润，伴随上皮细胞变性、坏死，上皮内亦有炎性细胞浸润；阴道组织主要表现为粘膜下充血和炎细胞浸润，上皮下有大量中性粒细胞浸润（图6B）。基础方治疗组大鼠组织形态改善不明显（图6C）。而七叶皂苷钠凝胶剂治疗组组织局部仅可见少量的炎性细胞浸润，无上皮变性和坏死（图6D、E）。

图5 七叶皂苷钠凝胶剂可有效缓解宫颈炎大鼠阴道红肿和脓性分泌物

图6 七叶皂苷钠凝胶剂可有效缓解宫颈炎大鼠阴道红肿和脓性分泌物

3 讨论

研究表明七叶皂苷具有抗组织水肿、抗渗出、改善血液循环和预防组织内水分存积等作用[14,17-18]，被广泛应用于临床治疗脑水肿或创伤性水肿、静脉回流障碍、痔疮或烧伤等疾病[4-5,19]。此外，七叶皂苷还具有显著的消炎作用[20]，如实验表明七叶皂苷对血栓性静脉炎、脑炎、关节炎等具有良好的治疗作用[21-22]，甚至有报道其抑炎效果可达氢化可的松的4～5倍。有文献报道七叶皂苷碱金属盐或氨基酸盐可用于治疗肺部急性炎症和水肿，且与传统消炎药物相比具有不抑制机体的免疫功能的优势。七叶皂苷还可联合关节滑膜切除术用于厚皮性骨膜病的治疗[23]。由于大部分临床炎症常常伴随明显的组织水肿[24]，因此七叶皂苷在消炎和抗组织水肿中的双重作用日益受到重视。

我们前期改良了传统七叶皂苷提取工艺，获得了简便（节省几十小时）、经济（使用水提或低浓度醇提代替高浓度醇提）和环保（去除了氯仿、乙醚等处理步骤）的七叶皂苷提取工艺。获得的产品制备成喷雾剂对大鼠组织水肿具有良好的治疗效果。虽然关于七叶皂苷用于消炎的研究有大量文献[14-17]，但是对于七叶皂苷用于宫颈炎治疗的研究鲜有报道。考虑到宫颈炎在成年女性中发病率极高且急性宫颈炎治疗不及时会发展为慢性宫颈炎，增加罹患宫颈癌和加剧HIV传播的风险[12]。因此，研发宫颈炎治疗药物具有重要的临床价值。目前宫颈炎的治疗为全身给予抗生素治疗，副作用大且容易诱发耐药菌出现。本研究中探索性地考察了七叶皂苷凝胶剂局部给药用于宫颈炎治疗的可行性。我们利用25%的苯酚胶浆通阴道局部给药高效率地诱导了宫颈炎模型，当给予七叶皂苷进行干预治疗时，发现七叶皂苷在2.5 mg/g凝胶的浓度下对宫颈炎具有显著的疗效，其明显减轻了模型大鼠的阴道红肿、减少了分泌物；阴道及宫颈组织水肿明显改善，组织病理学检查发现七叶皂苷治疗组大鼠宫颈组织中的炎性细胞浸润被显著抑制，无上皮细胞变性和坏死，血管充血情况也有明显的改善。

总之，七叶皂苷凝胶剂对宫颈炎模型大鼠具有良好的治疗作用，有望成为一种成本较小、使用方便、功能优异的宫颈炎治疗药物。