刺芫荽叶乙醇提取物的抗氧化活性

张建春，吴接呈，张筑宏，王兰英，骆焱平

(海南大学 植物保护学院，海口 570228)

刺芫荽(EryngiumfoetidumL.)别名野香菜、刺芹、洋芫荽等，为伞形科刺芹属多年生草本植物[1]，在我国主要分布于海南、广东、广西、云南等热带、亚热带地区[2]，是一种药蔬两用植物，具有显著的消炎、抑菌的功效，极具开发价值[3]。目前关于刺芫荽提取物的研究取得了一定进展，如文献[4]发现刺芫荽水煎剂具有局部抗炎作用和镇痛作用；文献[5]发现刺芫荽的己烷提取物也具有的抗炎活性，并且确定了其主要成分为谷甾醇；文献[6]发现刺芫荽新鲜及干燥叶水提物还能抑制蛇、蝎毒液对红细胞的溶血作用。文献[7]发现刺芫荽水提物对多种细菌有一定的抑制作用，其中，对白喉杆菌的作用较消炎散结片强。文献[8]发现刺芫荽叶提取物对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌等致病菌有较好的抑制作用[8]。文献[9]发现刺芫荽对胸膜炎模型大鼠炎性细胞因子的影响，说明其治疗感染性疾病的作用不单纯在于抗菌，而可能对复杂的细胞因子网络进行协调。可见刺芫荽提取物具备多种功效，备受科研者的广泛关注。本研究拟通过对刺芫荽叶乙醇提取物的总多酚、总黄酮的含量，对DPPH自由基和羟基自由基的清除作用以及对高价铁离子还原能力的测定来评价刺芫荽的抗氧化活性，以期为刺芫荽开发应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试药剂 刺芫荽提取物(刺芫荽采自海南省五指山地区)；芦丁、没食子酸和叔丁基对苯二酚(TBHQ)均购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 提取物的制备 将采集的刺芫荽叶洗净，室内自然阴干，碾碎，称质量后加入95%无水乙醇中，避光浸提3 d。抽滤，得到滤液。滤渣在相同条件下再浸提1次，合并滤液，减压浓缩，得到浸膏，置于室温阴凉处保存备用。

1.3 提取物总多酚含量的测定 参照文献[10]的方法测定，略有改动。用95%无水乙醇配制1 g·L-1的乙醇提取物样品，移取1 mL样品液于试管中，加入0.5 mL 福林-薛卡多(Folin-Ciocalteu)试剂和5 mL蒸馏水，充分混匀，在室温下反应5 min。再向试管中加入1 mL 5%碳酸钠溶液，混匀，室温下黑暗处理60 min。在760 nm处测定样品的吸光值，实验重复3次。以没食子酸(60，40，20，10，5，2.5 μg·mL-1)为标准样品绘制标准曲线，根据标准曲线计算提取物的总多酚含量。

1.4 提取物总黄酮含量的测定 参照文献[11]的方法，略有改动进行测定。用95%的乙醇配制1 g·L-1的乙醇提取物样品，移取0.5mL样品液于试管中，加入0.1 mL 10%氯化铝溶液、0.1 mL醋酸钾溶液、4.3 mL蒸馏水，充分混匀，室温下孵育30 min。在415 nm下测定样品液的吸光值，实验重复3次。以芦丁(0.32，0.16，0.08，0.04，0.02，0.01 g·L-1)为标准样品绘制标准曲线，根据标准曲线计算提取物的总黄酮含量。

1.5 提取物对DPPH自由基清除能力的测定 参照文献[12]方法进行，略有改动进行测定。将样品溶液稀释为1，0.8，0.6，0.4，0.2，0.1 g·L-1。取3.5 mL 2,2-二苯基-1-苦肼基(DPPH)溶液于试管中，向试管中加入0.5 mL不同浓度的样品溶液，充分摇匀，在室温下孵育30 min，在517 nm下测定的吸光度为A。用0.5 mL 95%无水乙醇代替样品溶液与3.5 mL DPPH溶液加入试管，测其吸光度为A1；用0.5 mL双蒸水代替样品液与3.5 mL的无水乙醇混合，同时以其作为空白对照，测95%无水乙醇和双蒸水的吸光度为A0。将芦丁稀释成与样品相同浓度的标准溶液作为阳性对照，代替样品进行上述实验，每组重复3次试验。并计算样品对DPPH自由基的清除率以及半数清除作用浓度IC50值。按以下公式计算：

式中：A为样品溶液和DPPH溶液的平均吸光度；A0为95%无水乙醇和双蒸水的平均吸光度；A1为95%无水乙醇和DPPH溶液的平均吸光度。

1.6 提取物对羟自由基(·OH)清除能力的测定 参照芬顿(Fenton)反应[13]的方法，略有改动。将样品溶液稀释为0.8，0.6，0.4，0.2，0.1，0.05 g·L-1。取300 μL样品溶液于试管中，依次加入1 mL 1.5 mmol·L-1硫酸铁溶液、0.7 mL 6 mmol·L-1过氧化氢溶液和1.2 mL 6 mmol·L-1水杨酸钠溶液，充分摇匀。37℃反应5 min，在510 nm下测定样品的吸光度为A1；用双蒸水代替样品液作空白对照，按同样步骤测吸光度为A0。每个处理重复3次，分别求吸光度平均值。以特丁基对苯二酚(TBHQ)作阳性对照，重复上述实验步骤。按以下公式计算：

式中：A0为空白对照平均吸光度；A1为加样品的平均吸光度；

1.7 提取物对高价铁离子还原能力的测定 参照文献[14]的方法，略有改动。取100 μL样品溶液于试管中，加入3 mL FRAP溶液[25 mL 300 mmol·L-1醋酸盐缓冲溶液、2.5 mL 0.01 mol·L-1三吡啶三嗪(TPTA)溶液、2.5 mL 0.02 mol·L-1六水合三氯化铁溶液]，充分摇匀。37 ℃反应30 min，在59 3nm测定样品的吸光度。七水合硫酸亚铁代替样品液，设置质量浓度梯度：0.2，0.1，0.05，0.025，0.012 5，0.006 5 g·L-1，重复上述实验。每个质量浓度重复3次，求吸光度平均值，并绘制标准曲线。

1.8 数据统计与分析 实验数据表示为平均值±标准差 (Mean±SD) , 采用spss22.0软件对数据进行分析处理，采用excel 2016作图。

2 结果与分析

2.1 提取物的总多酚含量测定 以没食子酸标准溶液质量浓度为横坐标，反应液的吸光度为纵坐标，拟合回归方程为y=0.005 6x+0.125 1，相关系数R2为0.981。表明没食子酸在质量浓度为0～80 mg·L-1范围内与其吸光度呈良好的线性关系，符合朗伯比尔定律，该方程可用于刺芫荽叶乙醇提取物总多酚的定量测定。测得刺芫荽叶乙醇提取物为1 g·L-1时总多酚相对超纯水吸光度平均值为0.255，由上述方程计算该样品的总多酚含量为1 mg提取物干粉的抗氧化能力相当(23.2±0.01)μg的没食子酸标准品 。

2.2 提取物的总黄酮含量测定 以芦丁为参比标准来衡量提取物中黄酮类化合物的含量，以芦丁的质量浓度为横坐标，505 nm处的吸光值为纵坐标绘制标准曲线，拟合回归方程为y=0.797x+0.162 3，相关系数R2为0.974 1，说明方程相关性好。测定0.5 g·L-1提取物的吸光值为0.541，由上述方程计算该提取物的总黄酮含量为1 mg提取物干粉的抗氧化能力相当于(0.96±0.02)μg的芦丁纯品。

2.3 提取物对DPPH自由基的清除能力测定 测定刺芫荽叶乙醇提取物对DPPH自由基的清除能力见图1，由图1可见，该提取物在0.1～1 g·L-1浓度范围内对DPPH自由基有较强的清除作用，且清除率随浓度的增大而升高。计算其回归方程为y=1.288 6x+5.410 4，相关系数R2为0.916，对DPPH自由基清除作用半抑制浓度(IC50)为0.48 g·L-1。同时测得芦丁回归方程为y=1.244 9x+5.741，相关系数R2为0.887，计算芦丁的半抑制浓度(IC50)为0.25 g·L-1。刺芫荽叶乙醇提取物对DPPH自由基清除作用稍弱于芦丁标准品。

图1 提取物及芦丁溶液DPPH自由基的清除率Fig.1 DPPH radical scavenging rate of extract and rutin图2 提取物及TBHQ溶液羟基自由基的清除作用Fig.2 Hydroxyl radical scavenging rate of extract and TBHQ

2.4 提取物对羟自由基(·OH)清除能力的测定 以2-叔丁基对苯二酚(TBHQ)为阳性对照，测定刺芫荽叶乙醇提取物对羟自由基的清除作用(图2)。由图2可见，在0.05～0.8 mg·mL-1浓度范围内，随着浓度的增加该提取物对羟自由基的清除作用逐渐增强。计算回归方程为y=0.749 7x+5.276 7，相关系数R2为0.936，对羟自由基清除作用半抑制浓度(IC50)为0.43 g·L-1。同时计算TBHQ标准品回归方程为y=0.998 1x+5.553 4，相关系数R2为0.917，对羟自由基清除作用半抑制浓度(IC50)为0.28 g·L-1。相比之下，刺芫荽叶乙醇提取物对羟自由基的清除活性低于TBHQ标准品。

2.5 提取物对高价铁离子的还原能力测定 以FeSO4质量浓度为横坐标，593 nm处吸光值为纵坐标，拟合回归方程为y=1.778 8x+0.002 6，相关系数R2为0.973。测得刺芫荽叶乙醇提取物为1 mg·mL-1时还原铁的相对超纯水吸光度平均值为0.358，由上述方程计算该样品还原铁的含量为1 mg提取物干粉的还原力相当于0.72 mmol·L-1的七水合硫酸亚铁。由此可见该提取物具有很好的高价铁离子的还原能力。

3 讨 论

本研究采用乙醇对刺芫荽叶进行浸提，测定了该提取物的总多酚含量、总黄酮含量以及对DPPH自由基、羟自由基的清除作用和高价铁离子的还原能力。结果表明：1 mg提取物干粉的抗氧化能力相当(23.2±0.01)μg的没食子酸标准品；1 mg提取物干粉的抗氧化能力相当于(0.96±0.02)μg的芦丁纯品；1 mg提取物干粉的还原力相当于0.72 mmol ·L-1的七水合硫酸亚铁；提取物对DPPH自由基和羟自由基的清除率低于对照的药剂。总体来看，提取物抗氧化活性较好。这一结论验证了刘志东[15]等人提出刺芫荽是天然抗氧化剂的重要来源这一观点。

自由基的清除是抗氧化剂发挥抗氧化作用的主要机理[16]。大量研究结果证明，刺芫荽全株含豆甾醇类物质, 嫩叶富含十二碳烯醛、十四烯醛、十二醛、月桂酸等多种芳香物质，如高燕等研究发现2-十二碳烯醛是刺芫荽特征香气的主要成分，具有柑橘和脂肪气味[17]。JAN BANOUT等的研究也证明了刺芫荽水提取物中2-十二碳烯醛是主要成分，其次是正十二烷醛，2-十四烯醛和1-十四烯[18]。本研究尚未对提取物成分进行分析，在后续研究中寻找清除自由基的物质是追踪刺芫荽抗氧化作用机理的关键。