徂徕山病死松树中线虫的分离及鉴定

高 锋，赵 涛，陈海燕，王怡霖，刘会香

（1.山东泰安市徂徕山林场，山东泰安271027； 2.山东农业大学植保学院，山东泰安271000）

徂徕山地处鲁中山区的中心位置，植被覆盖率达到了87.8%,具有重要的生态价值[1]。 松林面积达4400hm2，主要树种有油松、赤松、黑松。 目前徂徕山未发生松材线虫病，但随着松材线虫病的不断扩散蔓延，传入徂徕山的风险不断增加，为确保徂徕山松林资源安全，每年定期开展松材线虫病的普查和抽样检测工作，为探究徂徕山松树死亡原因，是否与松材线虫或拟松材线虫有关系，本研究调查了徂徕山10 个林区，采集了969 个样品，从形态学、分子生物学等方面对所分离到的线虫进行分析和评价。

拟松材线虫( Bursaphelenchus mucronatus) 属伞滑刃属， 在形态上与引起松树萎蔫病( Pine Wild Disease) 的松材线虫（B.xylophilus）极其相似。 早期研究认为，拟松材线虫致病力弱，在松树受到恶劣环境的影响或者松树被其他有害因子危害造成树势衰弱时，才会加速松树枯死[2-4]。 近年来，我国部分非松材线虫病发生区域也出现了大面积松林死亡，但是在死树中并没检测到松材线虫，却发现拟松材线虫[5-6]。 说明拟松材线虫对一些松树有较强致病性。 现有研究表明，拟松材线虫致病性存在三类分化：第一类是强致病力，致死率大于85%；第二类是微弱致病力和潜在致病力，在环境适宜条件下能够造成比较严重危害；第三类是无致病力[7-8]。 相比松材线虫而言，拟松材线虫分布更为广泛，徐红梅等研究发现， 在某些地区经常是拟松材线虫先出现，之后才有松材线虫出现[9]。

1 材料与方法

1.1 材料

2016-2018年定期在山东省泰安市徂徕山林场10 个林区，采集濒死木，刮除外皮后取木质部碎片，共采集969 个松树样本，带回室内进行检测。

1.2 方法

1.2.1 样品检测

采用贝尔曼漏斗法。 吸取收集到的液体50μL，显微镜观察是否有线虫及特征。

1.2.2 线虫鉴定

使用毛细管，挑取一定数量待检线虫在显微镜下观察其形态，观察线虫的大小和形态。 分子鉴定参照赵立荣（2005）所使用的线虫通用引物和松材线虫和拟松材线虫特异性引物[10]，然后挑取单条线虫，置于PCR 管中，先液氮浴中1 min，然后85℃水浴2min， 重复该步骤两次。 后加入蛋白酶K 2μL，56℃处理15 min 和95℃处理10min。 选用Taq MIX酶进行PCR 扩增，产物送至北京华大公司测序。 将测定的菌株序列提交到NCBI 上进行BLAST 比对，确定菌株的分类地位。

使用MEGA6 软件进行系统进化分析， 采用Neighbor joining method。 参比序列及GenBank 分类号为：Bursaphelenchus mucronatus （KF025318.1 、JQ729986.1、JQ729987.1、JF751070.1、JF317235.1、EF446953.1、EU296624.1、AM400247.1、AM400246.1、AY347916.1、AY347915.1、AY347914.1、JQ729985.1、MH923204.1）；Bursaphelenchus xylophilus（MH173065.1、MH173064.1、MH173062.1、MH173061.1、MH173060.1、MH172328.1、MH172326.1 、MH172325.1）。

2 结果与分析

2.1 分离线虫的鉴定

2.1.1 形态学特性

显微观察表明，徂徕山松木里面的线虫主要有两种，一种线虫雌虫尾部呈圆椎形，尾端指状，有明显的尾尖突，尾尖突长度约为3.80-5.71μm（图1）。角质层薄，上面布满圆形小环；唇区高，缢缩明显；口针基部增大；细长的食道腺覆盖于肠道上方，长度约为4 个体宽；神经环紧接在中食道球后方。 初步鉴定了拟松材线虫（图2）；另一类线虫为口针退化，尾尖突细长，为腐生线虫（图3）

图1 拟松材线虫尾尖突

图2 拟松材线虫的口针及中食道球

图3 腐生性线虫形态特征

2.1.2 分子鉴定

图4 PCR 扩增的结果，M 为DM5000 maker，1、2 为拟松材线虫

对多批次的线虫样品进行总DNA 提取， 按照松材线虫和拟松材线虫的特异引物进行PCR 扩增，其PCR 产物大小约为250bp （图4） 产物序列测定和 Blast 分析对比。 其均为拟松材线虫（Bursaphelenchus mucronatus）。 基于ITS 序列的聚类分析也表明它们与拟松材线虫聚在一起（图5）。综合形态学与分子生物学特征，确认送检的线虫均为拟松材线虫。

图5 所检测样品ITS 的NJ 系统进化分析

2.2 松木样品检测

徂徕山各林区松木样品送检检测结果见表1。

通过表1 可以看出， 徂徕山的10 个林区均发现了死亡的松树，其中茶石峪林区和徂徕林区所发现的死亡松树最多， 太平顶景区和上池植物园最少。 所发现死亡松树的主要树种为赤松， 占比达88.5%，其次为黑松占比为11.5%。 在所有死亡的松树样品中，存在大量蓝变现象，蓝变率为73.1%，样品中检测到了大量线虫，线虫的检出率为63.2%，其中拟松材线虫检出率为54.5%， 腐生性线虫检出率为8.7%；在不同树种的样品中，58.0%的赤松样品中检测到了拟松材线虫，27.0%的黑松样品中检测到了拟松材线虫， 说明赤松对拟松材线虫对更为敏感。

3 结论与讨论

3.1 本研究调查了徂徕山10 个林区， 采集了969个样品，从线虫形态学、分子序列测定方面进行了鉴定和测定。 研究显示，在徂徕山衰弱、病死木中发现了大量的拟松材线虫（Bursaphelenchus mucrona-tus）和腐生性线虫。

表1 徂徕山不同林区松木样品检测结果

3.2 此前的报道中，拟松材线虫对赤松（Pinus densiflora Sieb. et Zucc）、黄山松（Pinustaiwanensis hayata）和黑松（P. thunbergiiparl）、云南松（P.yunnanensis faranch）、思茅松（P. kesiya royle ex gordon var.langbianen）和高山松（P.densata）等的危害均有报道，常导致很多松林被毁[11-14]。 之前的一些报道中将拟松材线虫的致病力分为3 种:致病力很强,致死率大于85%的种群、较强的致病潜能的,在环境适宜的情况下可能造成严重危害的种群和几乎没有致病力的种群[7-8]。 徂徕山10 个林区松树死亡情况存在差异，茶石峪林区林区和徂徕林区所发现的衰弱和死亡松树最多， 太平顶景区和上池植物园最少，赤松死亡现象严重，占到了总调查数量的88.5%，黑松次之，黑松仅占到了11.5%，赤松上蓝变现象明显，拟松材线虫数量大，而黑松蓝变现象不明显，拟松材线虫数量少，说明徂徕山松树上的拟松材线虫与松树品种关系密切，是赤松死亡的主要原因，而黑松死亡可能与其它因素有关。

3.3 蓝变菌是指那些能把树木木质部染成蓝色或者蓝黑色的真菌类群，大多数蓝变菌都属于长嚎壳类真菌。 有相关的研究表明，蓝变菌和松材线虫一起随媒介昆虫侵入健康的松树体内, 感病松树出现异常后,蓝变菌会在树干中从上向下扩散。木材有无蓝变现象也是判断松木是否感染松材线虫的一个重要指标。同时蓝变菌是松材线虫最好的食物,对松材线虫的快速繁殖起一定作用[15]。 本试验采集了大量的松木样品，发现了大量的蓝变的松木，但是在蓝变的松木中却并没有检测到松材线虫。 蓝变的松木样品中检测到了拟松材线虫，说明蓝变菌也与拟松材线虫有着密切的关联，它们之间的关系还有待下一步探究。 另外在线虫检测中还发现有死亡松树木材中有变红现象，具体由哪一类病原引起有待进一步研究。