米非司酮单次和多次给药在Beagle犬体内的药代动力学研究

郭永，许保海，2，涂鹏程，3，裴开颜*

(1.国家卫生健康委科学技术研究所，北京 100081；2.遵义医学院细胞生物学教研室，遵义 563003；3.北京协和医学院，北京 100730)

20世纪90年代以来，以米非司酮为代表的紧急避孕药物受到越来越多的关注，并在基础及临床研究中取得了很大的进步。米非司酮的化学结构与孕酮相似，是一种高效的抗孕激素药物，可作用于月经周期不同时相，且半衰期较长，研究人员考虑将其用于常规避孕。本课题组曾对米非司酮每周一次口服的临床效果进行了初步研究[1-2]，研究结果均提示有希望将米非司酮每周一次口服发展为常规避孕方法。体内外研究均表明米非司酮对于治疗子宫肌瘤[3-4]、子宫内膜异位症[5-6]、子宫内膜癌[7]等具有很好的治疗作用，但目前适宜剂量和方案尚多在探索之中。因此考虑可以用于特定人群，如子宫肌瘤、子宫内膜异位症患者，发挥避孕和治疗疾病的双重功效。在进行临床试验之前，需要对米非司酮避孕新适应症进行临床前研究，评价其安全性和有效性，而有关动物体内米非司酮多次给药的药代动力学研究的报道较少，因此本文旨在利用前期已建立并确证的LC-MS/MS定量检测方法对米非司酮在Beagle(比格)犬体内单次和多次给药后的药动学进行研究，为米非司酮作为兼有治疗作用的避孕药物申请临床研究做准备。

材料和方法

一、动物及材料

1.实验动物：比格犬，雌性，普通级，8～12 kg，购自北京玛斯生物技术有限公司，实验动物生产许可证为SCXK(京)2016-0001。试验动物检疫观察14 d，观察动物的外观体征、行为活动、粪便性状、体重及饮食等指标，发现有病动物及时剔除。动物使用前经动物管理人员和专题负责人检查认可。

动物房环境条件控制室温18℃～24℃，相对湿度40%～70%，光照12 h明暗交替。普通饲料为犬维持料，购自北京华阜康生物技术股份有限公司。饮水：饮用纯化水，经酸化后自由饮用。

2.仪器：API 4000 Qtrap 液相色谱-质谱联用仪(Applied BioSystem，美国)，包括：API 4000 Qtrap 三重四极杆质谱、配有ESI源、Analyst 1.5.2 数据处理系统；液相部分为Agilent 1200高效液相色谱，配有G1312A 二元溶剂输送泵、G1367A 自动进样器、G1379A 脱气机、G1316A 柱温箱。

3.试剂：米非司酮标准物质：纯度>99%，批号72801608006(秦皇岛紫竹药业)；甲醇(批号：170237)、甲酸(批号：174477)、乙腈(批号：168772)、DMSO(批号：155977)、甲基叔丁基醚(MTBE，批号：166804)均为色谱纯(Fisher Scientific，美国)。

二、研究方法

1.实验分组：根据给药次数分为单次给药组和多次给药组，单次给药采用静脉和灌胃两种方式给药。单次静脉注射1 mg/kg，单次灌胃给药又分为低、中、高3个剂量组，分别是1、3、10 mg/kg 米非司酮，多次给药采用口服灌胃法给药，剂量为10 mg/kg。每组各3只比格犬。

2.给药方式和血浆样本采集：(1)单次静脉给药：静脉注射米非司酮1 mg/kg，给药前及给药后15、30 min，1、2、4、8、12、24、48、72、96 h采集血浆样本；(2)单次灌胃给药：单次灌胃分为低、中、高3个剂量组，分别是1、3、10 mg/kg 米非司酮，给药前和给药后15、30 min，1、2、4、8、12、24、48、72、96 h采集血浆样本；(3)多次灌胃给药：分别于第1、3、5、7、9、11、13、15 天灌胃10 mg/kg 米非司酮，给药前、后2 h取血，第15天给药前及给药后15、30 min，1、2、4、8、12、24、48、72、96 h取血。

血浆标本采集后EDTA抗凝，根据前期稳定性考察数据结果[8]，24 h以内的血浆保存于-4℃冰箱，24 h以后冻存于-80℃冰箱。

3.米非司酮血浆浓度检测：采用LC-MS/MS法，具体操作参照本研究前期方法学建立结果[8]。

4.药代动力学参数的计算：采用Phoenix WinNonlin软件处理比格犬单次和多次口服米非司酮后的血药浓度测定数据，采用非房室模型估算药代动力学参数，绘制药-时曲线。药代动力学主要参数包括：血浆生物半衰期(t1/2)、血浆药物浓度达峰时间(tmax)、血浆药物谷浓度(C0)、血浆药物峰浓度(Cmax)、药-时曲线线下面积(AUC)、表观分布容积(Vz)、稳态表观分布容积(Vss)、总体清除率(CL)、平均滞留时间(MRT)、生物利用度(F)。

三、统计学分析

结 果

一、单次给药比格犬体内米非司酮的药代动力学研究

单次灌胃1、3、10 mg/kg组比格犬体内米非司酮的药-时曲线如图1，其主要药动学参数如下，1 mg/kg组的t1/2值和MRT与3 mg/kg组和10 mg/kg组相比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，3 mg/kg组和10 mg/kg之间差异无统计学意义(P>0.05)；AUClast、AUCInf值的增长比值与给药剂量不成比例，呈现非线性药代动力学特征；3组的tmax值相比，差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

图1 单次给药比格犬体内米非司酮的药-时曲线

二、生物利用度

单次静脉注射1 mg/kg组和灌胃10 mg/kg组比格犬体内米非司酮的药-时曲线如图2。单次静脉给药主要药代动力学如下，t1/2为(16.38±0.95)h，C0为(604.59±114.26)ng/ml，AUClast为(577.42±206.74)h·ng·ml-1，AUCInf为(622.72±229.94)h·ng·ml-1，Vz 为(41.64±15.71)L/kg，Vss为(22.31±7.74)L/kg，CL 为(1.78±0.71)ml·min-1·kg-1，MRT为(12.80±1.50)h。生物利用度为52.6%。

三、多次灌胃给予10 mg/kg米非司酮的药代动力学研究

比格犬隔天一次(第1、3、5、7、9、11、13、15 天)灌胃给予10 mg/kg米非司酮后，用LC-MS/MS法检测血浆中米非司酮的浓度，绘制出平均血浆药物浓度-时间曲线(图3)。米非司酮组的主要药动学参数如下，t1/2(14.08±1.27)h和(32.96±6.96)h，Cmax为(565.33±41.97)ng/ml和(707.67±134.15)ng/ml，AUClast为(3 251.97±845.10)h·ng·ml-1和(5 190.39±2 231.04)h·ng·ml-1，AUCInf为(3 282.69±846.15)h·ng·ml-1和(5 626.17±2 655.38)h·ng·ml-1，MRT为(14.84±2.92)h和(26.09±8.85)h。单次灌胃10 mg/kg给药组和多次给药组的tmax、Cmax、AUClast、AUCInf、MRT等主要药动学参数相比较，差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。多次灌胃给米非司酮10 mg/kg后，分别检测第1、3、5、7、9、11、13和15 天的0 h和2 h的血药浓度，结果显示，比格犬体内的血药浓度保持稳定(图3)。

组 别例数t1/2(h)tmax (h)Cmax (ng/ml)单次灌胃1 mg/kg34.83±2.990.50±0.0081.97±5.143 mg/kg318.27±2.45*0.67±0.29122.17±41.2610 mg/kg314.08±1.27*0.50±0.00565.33±41.97多次灌胃10 mg/kg332.96±6.96#1.33±0.58#707.67±134.15组 别例数AUClast(h·ng·ml-1)AUCInf(h·ng·ml-1)MRT (h)F单次灌胃1 mg/kg3191.73±44.05202.69±51.604.19±2.9032.5#3 mg/kg3495.21±156.96*#532.56±162.27*#15.67±2.20*27.6#10 mg/kg33 251.97±845.10*3 282.69±846.15*14.84±2.92*52.6多次灌胃10 mg/kg35 190.39±2 231.045 626.17±2 655.3826.09±8.85NA

注：与单次1 mg/kg组相比较，*P<0.05；与单次10 mg/kg组相比较，#P<0.05

图2 单次静脉注射1 mg/kg组和灌胃10 mg/kg组比格犬体内米非司酮的药-时曲线

图3 比格犬多次灌胃给予10 mg/kg米非司酮的药-时曲线图

讨 论

目前报道的生物样本中米非司酮的分析测定方法主要有HPLC法[9-11]和RIA[12]。这两种方法试剂价格昂贵、步骤繁琐；RIA 法因存在放射性污染，且操作较为烦琐，不宜推广使用；HPLC虽然测定较为准确，但仍存在标本流动相配置复杂，检测时间长，最低定量下限较高等问题[13-14]。本研究采用前期优化后的建立的LC-MS/MS法[8]进行比格犬血浆中的米非司酮药代动力学研究，线性范围宽(1 000倍)，灵敏度可达1.0 ng/ml，血浆中米非司酮的线性范围均为1～1 000 ng/ml，样品回收率高。

单次静脉给药后，t1/2(16.38±0.95)h，AUClast为(577.42±206.74) h·ng·ml-1，AUCInf为(622.72±229.94)h·ng·ml-1，CL为(1.78±0.71)ml·min-1·kg-1，MRT为(12.80±1.50)h。另外不同浓度灌胃给药组结果相比发现，1 mg/kg组的t1/2值和MRT与3 mg/kg组和10 mg/kg组相比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，1、3和10 mg/kg单次灌胃给药后，米非司酮在比格犬体内呈现非线性药代动力学特征。结果提示，不同浓度米非司酮药物的吸收速度无明显差异，但随着剂量的增加，不存在线性关系。有研究采用RIA法进行口服10 mg/kg米非司酮人药代动力学的研究，结果显示Cmax为(1.41±0.31)μmol/L，平均tmax为1 h，t1/2为(19.6±4.55)h[12]，赵恒利等[15]采用LC-MS/MS法测定10 mg米非司酮人药代动力学的研究结果为Cmax为(476.4±223.1)μmol/L，tmax为(1.04±0.80)h，t1/2为(20.61±6.50)h。本研究与其相比较，结果有些差异，这可能是米非司酮在动物体内代谢非常快，半衰期很短，与人体内药代动力学研究结果有一定差异[16-17]。

本研究结果显示，比格犬单次和多次灌胃给予10 mg/ml剂量的米非司酮后，血药浓度分别在0.5 h和1 h达到峰值，多次给药后达峰时间稍微延长，这可能是食物的影响，使得药物的吸收错后。但单次给药组和多次给药组的tmax、Cmax、AUClast、AUCInf、MRT等主要药动学参数相比较，差异无统计学意义(P>0.05)。另外多次灌胃给米非司酮10 mg/kg后，分别检测第1、3、5、7、9、11、13、15 天的0 h和2 h的血药浓度，结果显示比格犬体内的血药浓度保持稳定，但t1/2和MRT明显延长、AUC明显增加，提示米非司酮在比格犬体内有一定蓄积。结果也提示单次给药后血药浓度低于多次给药后的血药浓度，我们推测一方面因为尚未达到稳态血药浓度，另一方面是由于多次灌胃未能像单次给药禁食过夜，因此口服药物在胃肠道里，食物对药物吸收的影响所致。