基于网络药理学的鸦胆子活性成分抗肿瘤分子机制

黄大兵，王玲玉，潘跃银

(中国科学技术大学附属第一医院 安徽省立医院肿瘤化疗科，安徽 合肥 230001)

恶性肿瘤是严重威胁人类生命健康的疾病，已经成为中国居民主要的死亡原因之一，目前临床治疗主要采用手术、放射治疗、化学治疗等，缺乏有效的治疗手段。日前，国家癌症中心发布了最新版的2018中国恶性肿瘤报告，报告显示2018年中国新增恶性肿瘤病例380.4万例，死亡病例229.6万例。在所有发病的恶性肿瘤中，肺癌为我国发病率最高的恶性肿瘤，其次是胃癌、结直肠癌、肝癌、女性乳腺癌等，这些均是我国常见的恶性肿瘤，其中肺癌发病率约占所有恶性肿瘤新发病例的77%，肺癌死亡率约占全部恶性肿瘤死亡病例的83%。

鸦胆子作为广谱抗癌药，用于对抗肺癌[1]、胃癌[2]、结直肠癌[3]、肝癌[4]、女性乳腺癌[5]等，有毒性和不良反应小等优点，广泛用于临床。从鸦胆子水提取物中现已发现鸦胆子苦素AI、鸦胆子苷AP、鸦胆子苦内酯AD、鸦胆子苦醇和鸦胆丁等30余种苦木内酯类成分。苦木内酯类是鸦胆子的特征性成分，多数有抗癌活性[6]。苦木内酯的抗肿瘤机制包括：①特异性地抑制拓扑异构酶Ⅱ，从而抑制肿瘤细胞的DNA合成；②诱导细胞凋亡和分化；③对肿瘤细胞耐药性产生有一定逆转作用[7]。目前研究发现鸦胆子活性成分较多，并对其抗癌作用的分子机制进行了深入的研究，但迄今尚无一种单一的化合物被用于临床治疗癌症。本研究拟利用网络药理学方法将鸦胆子多成分、多靶点、多通路、多疾病的关系网络进行呈现，探索其有效成分作用的靶点及其治疗疾病的作用机制。

1 资料与方法

1.1 鸦胆子主要活性成分查找 利用中药系统药理学数据库和分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP；http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)检索鸦胆子所含的所有化学成分。根据TCMSP的推荐，通过口服利用度(oral bioavailability，OB)和类药性(drug-likeness，DL)对所有化学成分进行筛选。OB是指药物被吸收进入全身循环系统的程度和速度，是客观评价药物口服生物利用度和内在质量的重要指标，也是判断生物活性分子是否具有药物潜质的关键指标；DL是药物代谢动力学特性和安全性的总和(包括溶解度、通透性和稳定性等)，与化合物理化性质和结构因素的相互作用有关，是评价成药性优劣的关键指标，可用于优选化合物、解释活性和DL分析结果、挖掘活性和DL的关系、分析化合物特性、预测体内药物代谢动力学特征、指导分子结构修饰等。化合物的OB、DL越高，表明其越有可能被开发成为临床药物[8-9]。本研究以OB≥30%、DL≥18%作为筛选条件[10]，对鸦胆子活性成分进行进一步筛选。

1.2 构建活性成分-靶标蛋白网络 DrugBank数据库是唯一将详细的药品数据(即化学、药理学和制药)与综合药物靶点信息(即序列、结构和作用通路)相结合的“生物信息学和化学信息学”资源。通过TCMSP导出鸦胆子活性成分，根据DrugBank获取活性成分的潜在靶分子，以构建鸦胆子的活性成分-靶标蛋白网络。

1.3 构建蛋白质-蛋白质相互作用网络(protein-protein interaction network，PPI) String数据库是一个搜寻PPI的数据库。既包括蛋白质之间的直接物理相互作用，也包括蛋白质之间的间接功能相关性。利用String数据库，置信度(两个蛋白质相互作用越强连线越粗)设定为0.9，构建这些靶分子的PPI，其中节点度值最高的基因JUN定义为核心基因，通过癌症和肿瘤基因图谱(the cancer genome atlas，TCGA)分析其在多种肿瘤的作用。

1.4 通路富集分析 R语言Cluster profiler包，即基因本体(gene ontology，GO)分析和京都基因和基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析的R包，可以对基因集合或基因簇进行功能聚类的统计分析和可视化。利用Cluster profiler包将这些靶分子进行GO和KEGG富集分析，节点度值表示网络中与节点相连边的数量，节点大小与其度值成正比；中介中心度主要表示网络中最短路径经过该节点的数量占路径总和的比例，反映该节点对整个网络的作用及影响力。各节点对应的参数值越大，则提示其在网络中的枢纽作用越重要[10]。采用差异基因中与该项目相关的基因数和矫正后的P值对该网络进行统计学分析，对各节点的重要性进行评估，以评价鸦胆子活性成分、靶标蛋白的重要程度。

2 结果

2.1 鸦胆子活性成分筛选结果和活性成分-靶标蛋白网络构建 从TCMSP数据库中筛选出鸦胆子潜在的活性成分(见表1)：鸦胆苦素C、鸦胆子苦醇、β-谷甾醇、鸦胆苷(B、C_qt、D、H、I、J、L、M、P)、鸦胆苦苷(A_qt、B)、木犀草素。根据DrugBank获取活性成分的潜在靶点：毒蕈碱乙酰胆碱受体(M1、M3、M5)、δ型阿片受体、5-羟色胺2A受体、α-1A肾上腺素能受体、μ型阿片受体、半胱胺酸蛋白酶-3、前列腺素G/H合酶1和2(PTGS1、PTGS2)、孕酮受体、一氧化氮合酶、胰岛素-1、肝细胞生长因子受体、热休克蛋白HSP90、1型非受体蛋白酪氨酸磷酸酶、DNA拓扑异构酶Ⅱ等，从而构建鸦胆子的活性成分-靶标蛋白网络(见表2)。利用String数据库，获取活性成分的靶蛋白：转录因子JUN、转录因子RELA、抑癌基因TP53、蛋白激酶B1(protein kinase B1，PKB1/Akt1)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等77种靶蛋白(见表3)。置信度设定为0.9，节点大小代表度值，构建这些靶蛋白的PPI网络，靶蛋白及其涉及肿瘤相关通路之间有着不同程度的关联和重叠部分，其中JUN、RELA、TP53、AKT1、MAPK1、VEGF等节点值和度值相对较高(见图1)。

表1 鸦胆子活性成分

2.2 GO分析和KEGG靶点通路分析 利用R语言Cluster profiler包将这些靶蛋白进行GO分析(细胞组分、分子功能、生物学过程)和KEGG靶点通路分析。通过GO分析，获取细胞组分、分子功能、生物学过程的富集条目，预测靶点的功能分布，大部分与肿瘤相关。靶点在细胞组分中，膜脂筏、膜微区、膜区较重要；在分子功能中，蛋白质异源二聚反应活性、神经递质受体活性、泛素类-蛋白连接酶结合作用突出；在生物学过程中，细胞对药物的反应和对抗生素反应所占比例较大。

通过KEGG靶点通路分析结果可知，鸦胆子主要通过JUN、RELA、TP53、B1(PKB1/AKT1)、TNF、APP、MAPK、VEGF等相关通路发挥作用。其中节点度值最高的基因JUN定义为核心基因，通过TCGA分析其在多种肿瘤的作用，其在乳腺癌、肺腺癌、肺鳞癌和卵巢癌中均呈现出在肿瘤组织表达高于正常组织(见图2)。结果表明JUN在肿瘤组织的活性高于正常组织，提示其低表达对机体具有保护作用。

表2 鸦胆子活性成分相关靶点

表3 鸦胆子活性成分-靶蛋白网络关键节点及其度值

3 讨论

中药活性的体现往往通过多成分-多靶点-多通路发挥作用。本研究构建的鸦胆子活性成分-靶蛋白通路中，TNF-α信号通路通过TNF和肿瘤坏死因子受体1结合而激活，激活的TNF-α信号通路可导致核转录因子κB核易位和c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38蛋白、JUN活化，促进促炎细胞因子、趋化因子、生长因子和TNF-α等的表达[11-13]。MAPK通路包括MAPK激酶激酶、MAPK激酶和MAPK，这3种激酶能依次激活，共同调节着细胞的生长、分化、对环境的应激适应、炎症反应等多种重要的细胞生理/病理过程。VEGF在内皮细胞的增殖和迁移中起着重要的作用，为生长中的肿瘤提供营养，使肿瘤细胞与宿主血管建立连续性，有研究表明VEGF高表达的卵巢癌患者预后差[14]。鸦胆子主要通过转录JUN、TNF、MAPK、AKT等相关因子和靶蛋白参与其相关通路在肿瘤发生发展中发挥作用，表明基于网络药理学对鸦胆子的通路预测和靶点筛选具有一定的准确性。

图1 鸦胆子活性成分-靶蛋白网络

图2 TCGA分析JUN在乳腺癌、肺腺癌、肺鳞癌和卵巢癌中的作用

本研究构建了鸦胆子“多成分-多靶点-多通路”的网络图，其中包括15种活性成分、158种靶点以及相关成分-靶标蛋白网络。鸦胆苷、鸦胆苦苷等是其主要抗肿瘤成分，根据细胞组分、分子功能、生物学过程的富集条目预测靶点的功能分布，大部分与肿瘤相关。同时鸦胆子在多种肿瘤中可能通过TNF、MAPK、VEGF、PI3K/Akt等信号通路参与抗炎、抗肿瘤等。鸦胆子转录核心基因JUN，其在肿瘤组织的活性高于正常组织，提示其低表达对机体具有保护作用。本分析结果可能为今后研究鸦胆子抗肿瘤机制提供新依据和新思路。