高效液相色谱法测定菠菜中维生素C的含量

汤冬梅 王雄辉 刘 敏 董文惠 林 磊

（嘉兴威凯检测技术有限公司 嘉兴 314050）

引言

维生素C又称抗坏血酸[1]，具有解毒[2]、抗癌症[3]、清除自由基等功能，是人体必需的营养素之一，广泛存在于新鲜蔬菜和水果中。研究表明，维生素C能阻断致癌物亚硝酸铵的形成[4]。在胃酸作用下，亚硝酸物首先与维生素C反应，导致没有足够的亚硝酸物与胺结合成亚硝酸铵。近年来胃癌在死亡病因中成逐渐下降趋势，研究人员意识到主要归功于食物有了冰箱冷藏，加以运输发达，人们能够吃到更新鲜的水果蔬菜，而吃盐腌或浸的食物相对减少的缘故。因此，如何提高水果蔬菜的保鲜效果，尽量减少维生素C的损失尤为重要。

本研究选用菠菜为电冰箱冷藏室果蔬盒中代表食物，采用高效液相色谱（HPLC）法测定其维生素C含量，通过比较菠菜存储不同周期维生素C的损失率，进而评估电冰箱的保鲜性能。

1 材料与方法

1.1 试验材料

用75 %的酒精擦拭电冰箱所有储藏间室内表面及冰箱所有储藏间室内各附件的表面并晾干，将电冰箱的温度控制装置设定在制造厂声明的的位置（冷藏室4 ℃，冷冻室-20 ℃，宽幅变温室-3 ℃，左右变温室0 ℃），预运行24 h。选择颜色为深绿色、无损伤、成熟度一致、带根的整棵菠菜作为样品。将（未经处理的）新鲜菠菜去掉泥土、黄叶和杂质，均匀化后150 g作为一个样本，根茎部用纸胶带缠绕固定成一束。待电冰箱稳定运行2 h后，置于电冰箱冷藏室果蔬盒中贮藏。

1.2 仪器与试剂

仪器：Agilent 1260型 高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司），AB135-S型电子天平（梅特勒-托利多），KQ-500E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），H1650-W型离心分离机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），各类玻璃器皿（均用二次蒸馏水冲洗后，再用丙酮清洗并于120 ℃烘干4 h后备用）。

试剂：偏磷酸（分析纯），磷酸二氢钾（分析纯），磷酸（分析纯），十六烷基三甲基溴化铵（色谱纯），甲醇（色谱纯），维生素C标准品（纯度99.8 %，Supelco）。

1.3 方法

1.3.1 试样制备

将150 g菠菜放入破壁机中全部粉碎，称取2 g（精确至0.001 g）混合均匀的试样于50 mL烧杯中，用20 g/L偏磷酸溶液超声5 min溶解后，转至50 mL容量瓶中用20 g/L偏磷酸溶液定容摇均。取部分液体以12 000 r/min转速离心10 min，取上清液经0.45 μm水相滤膜过滤，滤液待上机测试。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse PlusC18色谱柱（4.6×150 mm，3.5 μm）；检测器：二极管阵列检测器；流动相：采用等度洗脱，流动相A：6.8 g磷酸二氢钾和0.91 g十六烷基三甲基溴化铵，用水溶解定容至1 L（用磷酸调pH至2.5～2.8），流动相B：100 % 甲醇。按A:B=为98:2混合，过0.45 μm滤膜，超声脱气；流速：0.7 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：20 μL；检测波长：245 nm。

1.3.3 标准溶液配制

准确称取维生素C标准品0.01 g（精确至0.01 mg），用20 g/L偏磷酸溶液定容至100 mL，配制成浓度为0.1 mg/mL维生素C储备液。

2 结果与分析

2.1 系统适用性及专属性

系统适用性试验结果显示，维生素C的分离度大于1.5，其理论塔板数高于10 000，均符合要求；专属性试验结果显示，样品与维生素C标准品的出峰时间基本一致，如图1所示。

图1 维生素C液相色谱图

2.2 标准曲线及线性趋势

吸取维生素C储备液0 mL，0.05 mL，0.1 mL，0.2 mL，0.5 mL，1.0 mL到10 mL棕色容量瓶中，用20 g/L偏磷酸溶液定容混匀，配制成浓度分别为0 μg/mL，0.5 μg/mL，1 μg/mL，2 μg/mL，5 μg/mL，10 μg/mL标准系列，按上述色谱条件进样测试。以标准溶液质量浓度为横坐标，对应峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，拟合回归方程为y=131.027 7x-3.535 3，R2=0.999 8。结果表明维生素C在0～10 μg/mL范围内线性良好，见图2。

2.3 精密度

取同一试样，按上述色谱条件连续进样6次，测得维生素C峰面积的RSD为0.71 %，表明仪器精密度高，见表1。

2.4 重复性

取同一批样品，按1.3.1项试样制备的方法制备6份样液并按上述色谱条件进行测定，测得维生素C含量的RSD为0.97 %，表明方法重复性良好，见表2。

2.5 准确度

取同一批样品分成4份，每份约150 g，其中3份加入高、中、低三个浓度点的标准溶液，按1.3.1项处理后进行测定，每个浓度重复3次，结果显示高、中、低三个水平的加标回收率在94.7 %～98.1 %范围内，相对标准偏差在0.34 %～1.61 %之间，表明该方法准确度较理想，结果见表3。

2.6 稳定性

将样品溶液分别在室温、避光条件下放置0、1、2、3、4、5和6 h后，分别测维生素C的峰面积，结果表明避光保存比室温保存测得样液维生素C的含量要高，样液5 h后维生素C含量降低明显，因此测试需在4 h内完毕。

2.7 贮藏周期对菠菜中维生素C含量的影响

取5份150 g的菠菜置于电冰箱冷藏室果蔬盒相同位置分别贮藏3、7、10、12和14天后，按1.3.1方法进行处理后根据1.3.2色谱条件上机测定，测试结果见表4。

由表4数据可看出，电冰箱冷藏室温度在4 ℃状态下，菠菜置于果蔬盒中贮藏14天其损失率仅为4.18 %，贮藏周期较久。分析原因，果蔬盒模拟利于蔬菜存储的阴冷环境，隔绝蔬菜于水接触，降低了腐烂程度，且低温条件下有氧呼吸作用减弱，维生素C的分解减少，有利于维生素C含量的保持，而高温将促进维生素C的分解[6]。但是从数据上看菠菜贮藏7天以上维生素C的损失逐渐增高，为确保蔬菜新鲜，建议尽早食用。

图2 维生素C标准曲线图

表1 精密度试验结果

表2 重复性试验结果

表3 加标回收试验结果

表4 不同贮藏周期菠菜中维生素C的含量

3 结论

本文建立了一种快速测定菠菜中维生素C含量的方法，选用ZORBAX Eclipse Plus C18反相色谱柱重现性好，加标回收率较理想，该方法简便快速，数据可靠性高，适用广泛，可用于食品中维生素C的测定。并根据维生素C损失率对电冰箱果蔬盒贮藏菠菜周期进行考察，整个贮藏期维生素C含量总体呈下降趋势，贮藏初期下降缓慢，后期降幅较大，但在整个储藏期维生素C损失率相对来说较低，这主要得利于果蔬盒良好的贮藏环境。