氧氟沙星胶囊微生物限度检查方法的建立*

曹寒梅 ，蔡 虎 ，杨晓莉 ，常 春 ，傅 强 △

（1.西安交通大学药学院，陕西 西安 710061； 2.陕西浩瀚管理技术咨询有限公司，陕西 西安 710065；3.陕西省医疗器械质量监督检验院，陕西 咸阳 712046； 4.陕西省食品药品监督检验研究院，陕西 西安 710065）

氧氟沙星为第3代喹诺酮类抗菌药物，对需氧革兰阴性杆菌、肠杆菌科、假单胞菌属、支原体、衣原体、非典型分枝杆菌等均有良好的抗菌活性，尤其对需氧革兰阴性杆菌的抗菌活性最强。对氧氟沙星胶囊进行微生物限度检查时，需要消除样品的抑菌活性，真实地反映其微生物污染情况，防止出现假阴性检查结果。本研究中依照2015年版《中国药典（四部）》[1]进行方法适用性试验，利用氯化镁与喹诺酮类抗菌药物的络合作用及聚山梨酯80的中和作用，通过薄膜过滤法，在稀释剂、冲洗液、培养基中添加氯化镁及聚山梨酯80消除抑菌活性，建立氧氟沙星胶囊的微生物限度和控制菌大肠埃希菌的检查方法[2-3]。现报道如下。

1 材料

菌种：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]、枯草芽孢杆菌（Bacillus sub-tilis）[CMCC（B）63501]，白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]，大 肠 埃 希 菌 （Escherichia coli）[CMCC（B）44102]，均购自中国食品药品检定研究院，工作用菌株均为第3代。

仪器：LDZX-30KBS型压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；XY500JC型电子天平（常州市幸运电子设备有限公司）；HFsafe-1800TEⅡB2型生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司）；BSD-TX345型台式恒温振荡器（上海博讯实业有限公司）；HH-系列电热恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）；LRH-250F型生化培养箱、MJ 250FI型霉菌培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；FC752型薄膜过滤器（杭州泰林生物技术设备有限公司，批号为20160102）。

试药：氧氟沙星胶囊（某制药公司，批号为150801，规格为每粒0.1 g）；胰酪大豆胨琼脂培养基（批号为151107）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号为150824）、胰酪大豆胨液体培养基（批号为151114）、沙氏葡萄糖液体培养基（批号为1505252）、蛋白胨培养基（批号为160119）、麦康凯液体培养基（批号为 150911）、麦康凯琼脂培养基（批号为1504162），均购自北京三药科技开发公司；氯化钠（天津市致远化学试剂有限公司，批号为20160601）；氯化镁（天津市百世化工有限公司，批号为20150103）。

2 方法与结果[1，4-6]

2.1 菌液制备

将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的新鲜培养物分别接种于胰酪大豆胨液体培养基中，35℃培养24 h；将白色念珠菌的新鲜培养物接种于沙氏葡萄糖液体培养基中，25℃培养3 d。上述培养物用无菌0.9%氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；将黑曲霉的新鲜培养物接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，25℃培养7 d或直至获得丰富的孢子，加入5 mL含0.05%聚山梨酯80的无菌0.9%氯化钠溶液，洗脱孢子，收集孢子悬液，用含0.05%聚山梨酯80的无菌0.9%氯化钠溶液制成适宜浓度的孢子悬液。

2.2 供试液制备

取供试品10 g，加含5%聚山梨酯80的胰酪大豆胨液体培养基至100 mL，45℃恒温振荡15 min，制成1∶10(m/V)的供试液 A。取供试品10 g，加含5%聚山梨酯80的胰酪大豆胨液体培养基至90 mL，再加入10 mL 1 mol/L的氯化镁溶液，45℃恒温振荡15 min，制成1∶10(m/V)的供试液B。

2.3 微生物计数方法适用性试验

需氧菌总数计数方法：采用薄膜过滤法。试验组，取2.2项下供试液A、供试液B各1 mL，置含100 mL 1%聚山梨酯80的0.1%蛋白胨水溶液的薄膜过滤器中，滤过，用含1%聚山梨酯80的0.1%蛋白胨水溶液分别试验冲洗5次、8次，每次100 mL。在最后一次冲洗液中分别加入菌落数不超过100 cfu/mL的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉试验菌液各1 mL。制备好的滤膜，菌面朝上，贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上。供试品对照组，取制备好的供试液，以稀释液代替菌液，同试验组操作。菌液对照组，取不含中和剂的相应稀释液替代供试液，按试验组方法操作。中和剂对照组，取相应量稀释液替代供试品，同试验组方法操作。各组每株菌平行制备2皿，30～35℃培养2～3 d。计算平均菌落数，结果见表1和表2。

霉菌和酵母菌总数计数方法：采用平皿法。试验组，取2.2项下供试液A分装于2个无菌试管中，每管装量9.9 mL，再分别加入制备好的含菌量不大于104cfu/mL的白色念珠菌、黑曲霉试验菌液各0.1 mL。取制备好的试验组样品液1 mL，置直径为90 mm的无菌平皿中，注入温度不超过45℃熔化的沙氏葡萄糖琼脂培养基约20 mL，混匀，凝固，每株菌平行制备2皿，20～25℃培养3～5 d。同法测定供试品对照组、菌液对照组及中和剂对照组，并计算各组的平均菌落数。结果见表3。

表1 需氧菌总数计数方法的回收结果

表2 需氧菌总数计数方法回收结果

表3 霉菌和酵母菌总数计数方法的回收结果

2.4 控制菌检查方法适用性试验[7-9]

试验组：取供试液A 10 mL，加入含100 mL 1%聚山梨酯80的0.1%蛋白胨水溶液的滤器中，混匀，薄膜过滤，用含1%聚山梨酯80的0.1%蛋白胨水溶液分别冲洗3次、5次、8次，每次100 mL。滤完，取出滤膜，接种至300 mL胰酪大豆胨液体培养基中，各接入1 mL含菌量不大于100 cfu的大肠埃希菌菌液，混匀，35℃培养18 h。同法取供试液A 10 mL，加入含100 mL 1%聚山梨酯80的0.1%蛋白胨水溶液的滤器中，混匀薄膜过滤，用含1%聚山梨酯80的0.1%蛋白胨水溶液冲洗3次，每次100 mL。滤完，取出滤膜，接入至90 mL胰酪大豆胨液体培养基中，再加入10 mL 1 mol/L的氯化镁溶液，接入1 mL含菌量不大于100 cfu的大肠埃希菌菌液，混匀，35℃培养18 h。取上述各培养物1 mL接种至100 mL麦康凯液体培养基，42℃培养24 h。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，35℃培养18 h。阴性对照试验：以稀释液代替供试液，照相应控制菌检查方法检查。结果见表4。

表4 大肠埃希菌检查方法不同培养基不同体积的结果

由表1至表3可见，含5%聚山梨酯80或/和含有氯化镁的中和剂对照组的回收比值在0.5～2.0范围内，说明5%聚山梨酯80或/和含有0.1 mol/L氯化镁的中和剂对试验菌株无毒害作用。由表1及表2可见，氧氟沙星胶囊对细菌的抑制作用很强，采用含聚山梨酯80的中和剂，冲洗800 mL时，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌的回收比值均小于0.5，不能消除氧氟沙星胶囊对3种细菌的抑制作用，当在含聚山梨酯80稀释液中再添加氯化镁时，冲洗800 mL，可使金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉的回收比值均大于0.9，表明可采用该方法作为需要菌总数的计数方法。由表3可见，氧氟沙星胶囊对白色念珠菌和黑曲霉的抑制作用较弱，可采用含5%聚山梨酯80中和剂的常规法（1 mL/皿，10-1）作为霉菌和酵母菌总数的计数方法。由表4可见，当冲洗量为800mL且加大培养基体积为300 mL时，亦无法消除氧氟沙星胶囊对大肠埃希菌的抑制作用。当冲洗量为300 mL时，滤过后，将膜接入含10 mL 1 mol/L氯化镁的胰酪大豆胨液体培养基100 mL，即可检出阳性试验菌大肠埃希菌，且阴性对照试验无菌生长。说明该方法可作为控制菌大肠埃希菌的检查方法。

3 讨论

氧氟沙星胶囊对霉菌和酵母菌抑制作用较弱，因此霉菌和酵母菌总数采用常规平皿法即可。在预试验中，需氧菌以常规法试验，供试液稀释到1∶100（m/V）时，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的回收比值皆为0。由此可见，氧氟沙星胶囊对细菌有很强的抑菌活性，遂在薄膜过滤法过程中采用了最后一次冲洗时加入试验菌的方法，并取制备的1∶10供试液1 mL或10 mL加入含100 mL冲洗液滤器中，混匀后过滤，可有效防止药物颗粒堵塞薄膜。在中和剂的选择上，第一，氧氟沙星胶囊有较强的抑菌活性，首选添加聚山梨酯80，因为一定浓度的聚山梨酯80能促进胶囊剂的乳化与分散，并对抑菌活性有中和作用；第二，氧氟沙星胶囊为喹诺酮类抗菌药物，可与金属离子（Ca2+，Mg2+，Fe3+，Al3+）发生络合反应，使抗菌活性下降。试验中选择1%1 mol/L氯化镁和5%聚山梨酯80作为中和剂加入供试液中及1%聚山梨酯80加入冲洗液中。结果表明，在制备供试液中添加一定量的氯化镁并采用薄膜过滤法，对需氧菌的抑菌活性有明显的减弱作用，且在控制菌大肠埃希菌检查的方法适用性试验组中，增大培养基体积和增加冲洗都不如在增菌培养基中直接添加氯化镁消除抑菌效力作用明显。在日后的探索中，可以尝试将金属离子中和剂直接添加至琼脂培养基中，探索效果是否更佳，且可探索消除该类产品抑菌活性的金属离子的最低有效浓度[10-11]。