不同浓度异氟醚麻醉对新生大鼠远期认知功能的影响

孙 鼐，宋 琼，张 伟，夏贵山，吕东东，储勤军

0 引言

目前，多数手术在全身麻醉下进行，而妊娠后期及出生后早期是婴幼儿脑发育成熟的关键时期，此阶段进行手术、反复使用麻醉药物是否会影响婴幼儿智力发育，导致中枢神经损伤，一直是临床关注的重点问题[1-2]。陈旭辉等[3]研究显示，在哺乳类神经突出发育的关键时期应用N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)可影响中枢神经系统发育，导致神经细胞变性凋亡。NMDAR亚单位中，NMDAR2是与学习、记忆相关的重要亚型，脑突触长时程增强(LTP)现象多由NMDAR2诱导和维持，其表达水平上调可使LTP受抑制[4]。异氟醚是临床常用吸入麻醉药，可抑制突触前谷氨酸释放，增强谷氨酸再摄取，阻滞突触后NMDAR，从而发挥麻醉效果。目前，已有研究表明，异氟醚具有细胞毒性，可诱发新生大鼠神经元凋亡，影响其成年后学习记忆功能[5-6]。但关于异氟醚对发育期大鼠海马NMDAR2及谷氨酸转运体(GLAST)表达有无影响的文献鲜有报道。本研究使用新生大鼠建立异氟醚麻醉模型，观察不同浓度异氟醚麻醉对新生大鼠远期认知功能的影响，及其是否与海马NMDAR2、GLAST表达相关，进一步分析异氟醚导致新生大鼠认知功能障碍的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 新生SD大鼠40只，7 d龄，雌雄均有，体重18～20 g，由中山大学实验动物中心提供。随机均分为5组：吸入空气正常对照组(A组)，1.2%、1.8%异氟醚单次吸入组(B组、C组)，1.2%、1.8%异氟醚多次吸入组(D组、E组)。

1.2 模型制备 A组吸入空气6 h；B组、C组分别吸入1.2%、1.8%异氟醚(美国Abbott公司，批号：936245U) 6 h；D组、E组分别吸入1.2%、1.8%异氟醚3次，2 h/次。将大鼠放置在自制麻醉箱中实施麻醉，麻醉箱有2个侧孔，分别连接Drager麻醉机(调为手动模式，排气阀接近最小压力，通过调节挥发罐吸入浓度调整异氟醚吸入浓度)、Datex气体监测仪(监测流出气体中异氟醚浓度)，并使用婴儿脉搏血氧饱和度探头监测大鼠血氧饱和度及心率，防止麻醉过深导致大鼠脑缺氧。整个麻醉箱置于恒温水浴箱中，温度维持在30 ℃。采集尾部血(尾3 mm处剪短鼠尾采血)，使用美国雅培公司i-STAT型血气分析仪行血气分析。麻醉完毕后与母鼠同窝饲养。

1.3 认知功能测试 吸入异氟醚3周后行认知功能测试，测试过程中保持室内灯光、物品摆放等室内环境一致，排除环境干扰因素。

1.3.1 旷场实验 以无顶木箱(60 cm×60 cm×60 cm)作为旷场行为观察箱，使用墨线将箱底分为36个等分小方格。将大鼠置于中央格，观察大鼠在中央格停留时间及2 min内穿越格子数。

1.3.2 Morris水迷宫实验 以直径1.2 m、高0.5 m的圆桶作为水迷宫，将其划分为4个象限，加水后按0.5%～1.5%比例加入奶粉，使水池内水变为不透明乳白色，在第4象限内距池壁边缘30 cm处固定1个直径10 cm的圆柱型平台，平台约在水面下1.5 cm处，并控制水温于22～25 ℃，监测并记录大鼠运动情况。内容包括：①定位航行实验：记录大鼠游泳速率及逃逸潜伏期(2 min内寻找平台的时间)，上下午各4次，每次间隔30 min以上，取平均值；②空间探索实验：将平台从第1象限移除，大鼠任选一入水点入水，游泳60 s后停止，记录目标象限穿越次数、目标象限停留次数及探索时间(2 min内原平台处停留时间)[7-8]。

1.4 海马NMDAR2、GLAST表达检测 认知功能测试完成后将大鼠开胸，经左心室至升主动脉插管，给予100 ml生理盐水冲洗血液，然后使用4 ℃含40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L pH值为7.4的磷酸盐缓冲液灌流固定2 h，取脑置于4 ℃ 300 g/L蔗糖中直至组织沉底，使用冰片切片机连续冠状切片(厚度30 μm)，0.01 mol/L PBS重复漂洗3次(30 min/次)，20～23 ℃温度下加入含0.3%Triton X-100的0.01 mol/L PBS浸泡30 min。行免疫组织化学荧光染色，分别加入兔抗谷氨酸受体抗体稀释液(1∶1 000)及豚鼠抗GLAST抗体稀释液(1∶1 000)(美国Santa Cruz公司)，20～23 ℃温度下孵育24 h。加入荧光二抗(1∶500)(美国Sigma公司)抗血清，37 ℃温度下孵育2 h。0.01 mol/L PBS重复漂洗3次(30 min/次)，80%甘油封片，Confocal共聚焦显微镜观察，使用美国NIMH公司 Image J图像处理软件进行分析，以荧光半定量OD值表示NMDAR2、GLAST表达水平。

2 结果

2.1 旷场实验结果比较 各组旷场实验中央格停留时间及2 min内穿越格子数比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组旷场实验结果比较

2.2 定位航行实验结果比较 定位航行实验中，各组游泳速率比较差异无统计学意义(P>0.05)。与A组比较，B组、C组、D组、E组逃逸潜伏期均显著延长，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.3 空间探索实验结果比较 空间探索实验中，各组目标象限穿越次数、目标象限停留次数比较差异无统计学意义(P>0.05)；但与A组比较，B组、C组、D组、E组探索时间均显著缩短，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表2 各组定位航行实验结果比较

注：与A组比较，*P<0.05

表3 各组空间探索实验结果比较

注：与A组比较，*P<0.05

2.4 海马NMDAR2、GLAST表达水平比较 与A组比较，B组、C组、D组、E组NMDAR2、GLAST表达均显著升高，且C组高于B组，E组高于D组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表4、图1。

3 讨论

异氟醚是一种临床常用吸入性麻醉药，长时间吸入高浓度异氟醚可能会对神经功能造成损害，影响远期认知功能[9-11]。出生后7 d是大鼠神经系统发育的重要瓶颈期，此时神经系统极易受到损伤[12]，Johns等[13]按标准夹尾法测定大鼠异氟醚最低肺泡有效浓度(MAC)值(约为1.2%、1.8%)，故本研究选择7 d龄大鼠分别吸入1.2%、1.8%异氟醚。

表4 各组海马NMDAR2、GLAST表达水平比较

注：与A组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05；与D组比较，&P<0.05

本研究结果显示，各组旷场实验结果比较差异无统计学意义；定位航行实验中，各组游泳速率比较差异无统计学意义，但与吸入空气的A组比较，吸入异氟醚的B组、C组、D组、E组逃逸潜伏期均有显著延长。逃逸潜伏期可反映大鼠获取空间信息能力，本研究结果表明，吸入异氟醚麻醉大鼠空间信息能力降低。空间探索实验中，各组目标象限穿越次数、目标象限停留次数比较差异无统计学意义，但与吸入空气的A组比较，吸入异氟醚的B组、C组、D组、E组探索时间均有显著缩短。探索时间可反映大鼠记忆储存及提取再现能力，因而本研究提示，吸入异氟醚可导致大鼠记忆功能降低。Caffino等[14]实验已证实，氯胺酮、异氟醚麻醉药物可依赖性抑制鼠大脑皮层谷氨酸释放，但关于其增强NMDAR2受体和谷氨酸转运体GLAST的表达却未见相关报道。

本研究进一步分析异氟醚导致新生大鼠认知功能障碍的作用机制，结果显示，与吸入空气的A组比较，吸入异氟醚的B组、C组、D组、E组NMDAR2、GLAST表达均显著升高。NMDAR是处于神经元突触后膜的特殊离子通道，受突触电压及谷氨酸神经递质双重调控，其受体功能具有双面性，与学习记忆功能密切相关[15-16]。NMDAR激活可导致钙离子(Ca2+)通道开放，增加Ca2+内流，从而调控兴奋性突触传递及发育过程中的突触可塑性，提高学习记忆功能。但过度激活NMDAR，增加Ca2+内流，导致对Ca2+敏感的酶类大量激活，产生大量氧自由基，可导致线粒体损害及细胞凋亡，通过磷酸化过程影响神经元存活，损伤学习记忆功能[17-18]。丁一等[19]研究证实，NMDAR受体表达上调可引起神经兴奋性毒性增加。GLAST可逆浓度差将细胞外谷氨酸转运入神经细胞内，可抑制突触间隙谷氨酸浓度升高，继而产生神经细胞毒作用[20-21]。Xu等[22]研究证实，GLAST过表达可导致大鼠海马CA1区椎体细胞易损性增加，继而影响大鼠神经记忆功能。本研究还发现，吸入1.8%高浓度异氟醚大鼠的NMDAR2、GLAST表达高于吸入1.2%低浓度异氟醚大鼠，进一步证实在神经系统发育关键时期，使用异氟醚吸入麻醉可增加NMDAR数量，增强谷氨酸再摄取能力，导致神经兴奋性增加，从而影响大鼠认知功能，且其作用具有剂量依赖性；而异氟醚上调GLAST表达作用或与异氟醚降低突触间隙谷氨酸浓度相关。

图1 不同浓度异氟醚麻醉对新生大鼠海马NMDAR2、GLAST表达影响的免疫荧光标记图

综上所述，吸入异氟醚麻醉可导致新生大鼠远期认知功能降低，其作用机制或与海马NMDAR2、GLAST表达上调相关，而这种上调作用与吸入异氟醚浓度具有一定剂量依赖性。