替莫唑胺联合氟桂利嗪对胶质瘤细胞体外作用机制

卢家潮　寿记新　李龙龙　王冰冰

【摘要】 目的：探讨替莫唑胺（TMZ）联合氟桂利嗪（FZ）对人脑胶质瘤细胞体外清除作用及可能机制。方法：用伊格尔培养基培养胶质瘤U87、U251、CHG-5、SHG-44细胞株，用CCK-8试剂检测并评价TMZ、FZ两者单药及联合用药处理后的U87、U251、CHG-5、SHG-44细胞增殖抑制率及观察TMZ的半数抑制浓度（IC50）;流式细胞仪检测细胞凋亡。结果：FZ单独处理胶质瘤细胞株后能起到一定的抑制作用，而远远起不到治疗效果;在同类细胞中，TMZ单药作用细胞株后IC50分别为（562.3±56.7）、（370.5±40.2）、（480.9±29.6）、（420.5±61.4）μg/mL。在不同浓度的FZ联合TMZ应用后TMZ IC50均有不同程度下降（P<0.05）;与对照组、替莫唑胺、氟桂利嗪单药作用组比较，TMZ联合FZ用药诱导胶质瘤细胞凋亡率显著提高。结论：FZ可抑制胶质瘤U87、U251、CHG-5、SHG-4增殖，与TMZ联合应用后能提高化疗效果。

【关键词】 替莫唑胺; 氟桂利嗪; 胶质瘤

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of Temozolomide（TMZ）combined with Flunarizine（FZ）on glioma cell lines in vitro.Method：The glioma U87，U251，CHG-5 and SHG-44 cell lines were cultured in Eagles medium，Cell Counting Kit-8（CCK-8）assay was used to evaluate the cell proliferation in glioma cell lines which treated with TMZ combined with FZ either alone or in combination.Result：FZ inhibited the proliferation of glioma cell lines，but it was far less therapeutic effect.In the same kind of cells，the 50% inhibitory concentration（IC50）of FZ in cell lines U87，U251，CHG-5，SHG-44 were（562.3±56.7），（370.5±40.2），（480.9±29.6），（420.5±61.4）μg/mL.The IC50 of TMZ was significantly decreased after different concentrations of FZ combined with TMZ（P<0.05）.Compared with the control group，TMZ and FZ monotherapy group，the apoptotic rate of TMZ combined with FZ induced a significant increase of glioma cells.Conclusion：FZ could inhibit the proliferation of glioma U87，U251，CHG-5 and SHG-4，and it could improve the chemotherapy effect when combined with TMZ.

【Key words】 Temozolomide; Flunarizine; Glioma

First-authors address：The Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.03.002

神經胶质瘤是人类中枢神经系统中最常见的原发性肿瘤，占恶性脑瘤的81%，影响胶质瘤发病的因素较多，如基因突变、电离辐射等[1]，最新的权威报道，胶质瘤发病率（1～5）/10万，超过3年的生存率仅5%[2]。约50%胶质瘤患者存在癫痫风险，氟桂利嗪（Flunarizine，FZ）为双氟化哌啶衍生物，是强效的钙通道拮抗剂，临床上常用的抗癫痫药物之一[3]。替莫唑胺（Temozolomide，TMZ）是一种口服的烷基化广谱抗肿瘤药物，通过DNA上的鸟嘌呤在O-6或N-7位上诱导DNA烷基化，致使肿瘤细胞凋亡[4]，其作为临床上一线的抗肿瘤药物，能明显延长胶质瘤患者生存期，但Chio等[5]研究发现，长期使用替莫唑胺作用于胶质瘤细胞会使其产生耐药性，临床上同样见有类似报道[6]。如何提高胶质瘤细胞对TMZ的敏感性，增强抗肿瘤作用已经成为目前研究热点，而关于TMZ与FZ联合应用对U87、U251、CHG-5、SHG-44细胞株的影响目前尚未见相关报道。本研究拟探讨体外FZ能否增加胶质瘤细胞对TMZ的敏感性、增强TMZ对肿瘤细胞的杀伤作用，为临床治疗胶质瘤患者提供相关的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器 流式细胞仪（BD calibur）、酶联免疫检测仪（上海基因科技有限公司）、胎牛血清（Gibco）、Eagle培养基（DMEM）（Hyclone公司）、0.25%胰酶（杭州四季青生物科技有限公司）、超净工作台（美国贝克曼公司）、CO2恒温培养箱（Cell Signaling公司）、TMZ（天士力公司）、FZ（西安杨森制药有限公司）、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）、CCK-8溶液（cell counting kit-8，Dojindo）。

1.2 细胞培养 胶质瘤U87、U251、CHG-5、SHG-44细胞株购自中科院上海细胞库，于含10%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM的高糖培养基，在室温下5%CO2的孵育箱培养。取对数生长期细胞且活性>95%用于实验。

1.3 方法

1.3.1 细胞抗增殖试验 取对数生长期的U87、U251、CHG-5、SHG-44细胞悬液接种于96孔板，每孔3 000个，预先置于37 ℃，5%CO2饱和湿度的培养箱内培养，使细胞贴壁生长并长满孔底。24 h后将各浓度药物10 μL加入培养孔，每浓度药物设4个复孔，空白组（无细胞、试剂）4个复孔，对照组（只有等量溶剂）4个复孔。各药液细胞培养孔的FZ、TMZ、FZ+TMZ浓度分别为FZ（5、10、20、40、80 μg/mL），TMZ（50、100、200、400、800 μg/mL），继续培养24 h后每孔加10 μL的CCK-8溶液，孵育2 h在酶联免疫检测仪450 nm处检测光吸收值（optical density，OD值），然后计算不同浓度的增殖抑制率。以上实验均重复3次取均值计算增殖抑制率和联合用药后TMZ的IC50，

1.3.2 流式细胞术检测细胞凋亡率 取同步培养的对数生长期U87、U251、CHG-5、SHG-44细胞加入对照组以及用DMSO配置的FZ、TMZ、FZ+TMZ（FZ终浓度为10、20、40 μg/mL，TMZ的终浓度为100、200、400 μg/mL），每组药物设3个复孔，按照凋亡试剂盒的说明进行操作后经流式细胞仪检测。

1.4 统计学处理 采用SPSS 21.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用Students t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FZ、TMZ单药作用于U87、U251、CHG-5、SHG-44细胞的增殖抑制率比较 FZ单药对胶质瘤细胞有一定的抑制作用，但达不到治疗效果，见表1。

2.2 FZ与TMZ联合用药对胶质瘤细胞株的增殖抑制作用 联合处理后TMZ的IC50均有不同程度的下降，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

2.3 TMZ、FZ及其联合用药对U87、U251、CHG-5、SHG-44细胞株凋亡率比较 对照组与各浓度药物FZ、TMZ、FZ+TMZ培养至24 h后，对U87、U251、CHG-5、SHG-44细胞的凋亡率比较，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。

3 讨论

原发性膠质瘤难以根治的原因主要是其具有丰富的血供、高度的浸润性及肿瘤边界不清等特点[7-8]，手术切除是目前治疗胶质瘤的第一选择方案，但由于肿瘤切除不完全，胶质瘤患者复发率极高，预后效果欠佳，严重危害患者生活质量及生命健康[9]。改进治疗方案及策略，提高胶质瘤患者生存期和生活质量是临床工作者亟待解决的问题。临床大样本数据证实，恶性胶质瘤患者行手术+放疗+化疗，目前已达成共识[10]。而Fisher等[11]在肿瘤放射治疗试验（RTOG）0424组证实，手术后行放疗+TMZ化疗较单纯行术后放疗，中位生存时间（MST）从40.5个月提高到57.9个月，提高率为43%，三年总体生存率（OS）从54%提高到65%。TMZ早在1980年被合成，且易于通过血脑屏障，目前成熟应用于临床一线的化疗药[12]，不少学者报道，原发性或复发性胶质瘤术后患者初次口服TMZ获得良好效果，但不少患者逐步产生耐药性[13-14]，因此研究胶质瘤细胞对TMZ的治疗增敏，有望提高胶质瘤术后患者的治疗效果。FZ是一种非选择性的能阻断T型和L型Ca离子通道阻断剂，普遍应用于胶质瘤伴随癫痫发作患者[15]。Lee等[16]曾应用10余种抗癫痫药作用于胶质瘤U87、T98G细胞株，发现所研究的抗癫痫药对胶质瘤细胞均有一定的抑制作用（没有一种能达到杀灭肿瘤细胞的作用），其中以奥卡西平和丙戊酸钠抑制作用显著，但两者的抑制作用浓度远远超过临床以预防、控制癫痫发作所需要的药物浓度，因此该剂量药物并不能作为抗肿瘤药物来推广使用。Schmeel等[17]在研究多发性骨髓瘤时发现，无翼相关整合位点（WNT）通路在淋巴瘤和骨髓瘤组织细胞中异常活跃，而FZ的化学特性与已知的WNT通路抑制剂相似，在白血病细胞中具有促凋亡作用。Koller等[18]使用三种WNT抑制剂作用于肾癌细胞，结果发现肾癌细胞长时间处于生长停滞状态，该抑制剂能抑制癌细胞内谷胱甘肽-s-转移酶（GST），导致癌细胞内谷胱甘肽水平升高，氧化应激进一步增强导致细胞死亡，文献[19-21]认为WNT通路抑制剂能增敏抗肿瘤药物的细胞毒作用。Perin等[22]研究表明，FZ与常用化疗药物联用时，FZ对肿瘤细胞膜的分裂融合有明显的抑制作用，同时能增强化疗药物的药物敏感性，不受动物组不同肿瘤的影响，化疗效果显著增强。

本研究发现，FZ与TMZ联合用药作用于U87、U251、CHG-5、SHG-44细胞株可以显著降低TMZ的IC50，即FZ能起到增敏TMZ的作用，FZ单药作用于该细胞，只能起到一定的增殖抑制作用，但达不到杀灭肿瘤细胞的效果，这可能是由于FZ作为WTN通路的一种抑制剂，能抑制胶质瘤细胞内谷胱甘肽-s-转移酶活性，致使谷胱甘肽的蛋白水平高升高，从而增敏TMZ的抗肿瘤作用，这与Koller等[18]研究结果类似。

综上所述，FZ作为一种临床常用的抗癫痫药，对胶质瘤细胞有一定生长抑制作用，但达不到细胞毒效应，在胶质瘤细胞中能增敏TMZ的抗肿瘤作用，因此，临床上推荐胶质瘤术后患者应用TMZ化疗的同时应用FZ是一个不错的治疗方案，既起到预防/治疗癫痫的作用，又能提高TMZ的治疗效果。但其复杂的联合应用机制，有待进一步研究。

參考文献

[1] Hu J，Shi B，Liu X，et al.The activation of Toll-like receptor 4 reverses tumor differentiation in human glioma U251 cells via Notch pathway[J].Int Immunopharmacol，2018，64：33-41.

[2] Torres-Bayona S，Aldaz P，Auzmendi-Iriarte J，et al.PR-LncRNA signature regulates glioma cell activity through expression of SOX factors[J].Sci Rep，2018，8（1）：12746.

[3] Sendrowski K，Rusak M，Sobaniec P，et al.Study of the protective effect of calcium channel blockers against neuronal damage induced by glutamate in cultured hippocampal neurons[J].Pharmacol Rep，2013，65（3）：730-736.

[4] Di M A，Sedlarik V，et al.Amphiphilic chitosan-grafted-functionalized polylactic acid based nanoparticles as a delivery system for doxorubicin and temozolomide co-therapy[J].Int J Pharm，2014，474（1-2）：134-145.

[5] Chio C C，Chen K Y，Chang C K，et al.Improved effects of honokiol on temozolomide-induced autophagy and apoptosis of drug-sensitive and -tolerant glioma cells[J].BMC Cancer，2018，18（1）：379.

[6] Reyes-Botero G，Cartalat-Carel S，Chinot O L，et al.Temozolomide Plus Bevacizumab in Elderly Patients with Newly Diagnosed Glioblastoma and Poor Performance Status：An ANOCEF Phase Ⅱ Trial（ATAG）[J].Oncologist，2018，23（5）：524-e44.

[7] Bai Y H，Zhan Y B，Yu B，et al.A Novel Tumor-Suppressor，CDH18，Inhibits Glioma Cell Invasiveness Via UQCRC2 and Correlates with the Prognosis of Glioma Patients[J].Cell Physiol Biochem，2018，48（4）：1755-1770.

[8] Alfonso J C L，Talkenberger K，Seifert M，et al.The biology and mathematical modelling of glioma invasion：a review[J].J R Soc Interface，2017，14（136）：pii20170490.

[9] Guan X，Zhang C，Zhao J，et al.CMTM6 overexpression is associated with molecular and clinical characteristics of malignancy and predicts poor prognosis in gliomas[J].EBioMedicine，2018，35：233-243.

[10] Gupta M，Bansal S，Pruthi D S，et al.Prognostic Factors in Elderly Patients with High-grade Gliomas：A Retrospective Analysis of 24 Cases[J].J Neurosci Rural Pract，2018，9（3）：312-316.

[11] Fisher B J，Hu C，Macdonald D R，et al.Phase 2 study of temozolomide-based chemoradiation therapy for high-risk low-grade gliomas：preliminary results of Radiation Therapy Oncology Group 0424[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys，2015，91（3）：497-504.

[12] Cousin D，Hummersone M G，Bradshaw T D，et al.Synthesis and growth-inhibitory activities of imidazo[5，1-d]-1，2，3，5-tetrazine-8-carboxamides related to the anti-tumour drug temozolomide，with appended silicon，benzyl and heteromethyl groups at the 3-position[J].Medchemcomm，2018，9（3）：545-553.

[13] St-Coeur P D，Touaibia M，Cuperlovic-Culf M，et al.Leveraging metabolomics to assess the next generation of temozolomide-based therapeutic approaches for glioblastomas[J].Genomics Proteomics Bioinformatics，2013，11（4）：199-206.

[14] Cheng L，Bao S，Rich J N，et al.Potential therapeutic implications of cancer stem cells in glioblastoma[J].Biochem Pharmacol，2010，80（5）：654-665.

[15] Gulati P，Muthuraman A，Kaur P，et al.Investigation of the role of non-selective calcium channel blocker（flunarizine）on cerebral ischemic-reperfusion associated cognitive dysfunction in aged mice[J].Pharmacol Biochem Behav，2015，131：26-32.

[16] Lee C Y，Lai H Y，Chiu A，et al.The effects of antiepileptic drugs on the growth of glioblastoma cell lines[J].J Neurooncol，2016，127（3）：445-453.

[17] Schmeel L C，Schmeel F C，Kim Y，et al.Flunarizine exhibits in vitro efficacy against lymphoma and multiple myeloma cells[J].Anticancer Res，2015，35（3）：1369-1376.

[18] Koller C M，Kim Y，Schmidt-Wolf I G，et al.Targeting renal cancer with a combination of WNT inhibitors and a bi-functional peptide[J].Anticancer Res，2013，33（6）：2435-2440.

[19] Mohhammed M K，Shao C，Wang J，et al.Wnt/β-catenin signaling plays an ever-expanding role in stem cell self-renewal，tumorigenesis and cancer chemoresistance[J].Genes & Diseases，2016，3（1）：11-40.

[20] Katoh M，Katoh M.Molecular genetics and targeted therapy of WNT-related human diseases（Review）[J].International Journal of Molecular Medicine，2017，40（3）：587-606.

[21] Yang K，Wang X，Zhang H，et al.The evolving roles of canonical WNT signaling in stem cells and tumorigenesis：Implications in targeted cancer therapies[J].Lab Invest，2016，96（2）：116-136.

[22] Perin P M，Haid S，Brown R J，et al.Flunarizine Prevents Hepatitis C Virus Membrane Fusion in a Genotype-dependent Manner by Targeting the Potential Fusion Peptide within E1[J].Hepatology，2016，63（1）：49-62.

（收稿日期：2018-11-02） （本文編辑：程旭然）