溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜中E选择素与P选择素的表达及意义

李威　李震　陈君卓　赵君雅　徐杰　于鹏 官杰

【摘要】 目的：探讨E选择素、P选择素在溃疡性结肠炎（UC）大鼠肠黏膜中的表达水平及意义。方法：选取2018年3-6月健康的雄性（Sprague Dawkey，SD）大鼠65只，分为空白对照组（n=12）和實验组（n=53）。空白对照组不处理，于实验组中随机选取12只SD大鼠进行预实验，筛选最合适剂量的TNBS（2，4，6-三硝基苯磺酸）造模剂构建溃疡性结肠炎的模型。剩余大鼠进行正式造模，按不同的解剖时间将其分为A、B、C组，各12只。通过每天观察体重及一般情况（精神状态，粪便形状、颜色等）的改变，依据疾病活动指数（disease activity index，DAI）评分，记录实验大鼠状态，初步判断大鼠溃疡性结肠炎的严重程度。分别于第3、7、14天处死大鼠，使用大体形态损伤指数（colon macroscopic damage index，CMDI）对结肠评分，判断溃疡程度，采用ELISA法检测肠黏膜中E选择素、P选择素的含量指标，同时评估结肠病理改变，综合得出E选择素与P选择素的含量与溃疡程度的关系。结果：实验组大鼠的DAI、CMDI评分均明显高于空白对照组，且实验组结肠组织的病理情况镜下溃疡改变显著。空白对照组、A、B、C组间的E选择素、P选择素含量比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。溃疡性结肠炎由逐渐严重至恢复的过程中，各实验组肠黏膜组织中的E选择素、P选择素水平均先逐渐升高随后下降，但C组含量仍均明显高于A组。结论：在溃疡性结肠炎发展过程中，随着结肠溃疡程度加重，E选择素和P选择素水平升高。随着结肠溃疡程度减轻，E选择素和P选择素水平降低。E选择素与P选择素可能起到了促进UC病情发展的作用，可作为UC诊断的动态参考指标，以及为临床研究UC发病机制提供新的方向。

【关键词】 UC; SD大鼠; CMDI; DAI; P选择素; E选择素

【Abstract】 Objective：To investigate the expression levels and significance of E-selectin and P-selectin in intestinal mucosa of rats with ulcerative colitis（UC）.Method：A total of 65 healthy male（Sprague Dawkey，SD）rats were selected from March to June 2018，they were divided into blank control group（n=12）and experimental group（n=53）.The blank control group was not treated，12 SD rats were randomly selected from the experimental group for the pre-experiment，and the most appropriate dose of TNBS（2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid）was screened to build the model of ulcerative colitis.The remaining rats were formally moulded and divided into group A，group B and group C according to different anatomical time，with 12 rats in each group.Through daily observation of body weight and changes in general conditions（mental state，shape and color of feces，etc.），according to disease activity index（DAI）score，the status of experimental rats were recorded and the severity of ulcerative colitis in rats was preliminarily determined.Rats were sacrificed on 3，7 and 14 d respectively，and colon macroscopic damage index（CMDI）was used to assess the degree of ulceration.ELISA method was used to detect the content indexes of E-selectin and P-selectin in intestinal mucosa，and meanwhile the pathological changes of Colon were evaluated.The correlation between the content of E-selectin and P-selectin and the degree of ulcer was obtained.Result：The DAI and CMDI scores of rats in the experimental group were significantly higher than those in the blank control group，and the pathological changes of colonic ulcer in the experimental group were significantly changed under the microscope.The contents of E-selectin and P-selectin in blank control group，A，B and C groups were compared，the differences were statistically significant（P<0.05）.In the course of recovery from ulcerative colitis，the levels of E-selectin and P-selectin in intestinal mucosa of experimental group increased gradually at first and then decreased，but the contents of E-selectin and P-selectin in group C were still significantly higher than those in group A.Conclusion：During the development of ulcerative colitis，the levels of E-selectin and P-selectin increased with the aggravation of the degree of colon ulcer.The levels of E selectin and P-selectin decreased with the decrease of degree of colon ulcer.E-selectin and P-selectin may play a role in promoting the development of UC，which can be used as a dynamic reference indicator for the diagnosis of UC and provide a new direction for the clinical study on the pathogenesis of UC.

【Key words】 UC; SD rats; CDMI; DAI; P-selectin; E-selectin

First-authors address：Qiqihar Medical University，Qiqihar 161000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.01.008

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种直肠和结肠慢性非特异性炎症性疾病，该疾病可发生于任何年龄，多见于青年和中年人，男女比例相近，近年来此病的发病率呈明显上升的趋势[1]。临床主要表现为腹痛、腹泻、黏液脓血便，患者病情经久不愈、反复发作，常表现为发作期与缓解期交替出现。UC的发病机制尚未明确，目前认为该病与遗传、环境和机体免疫功能紊乱等有关，在这些因素的作用下，肠道免疫系统功能紊乱。同时，临床研究还表明UC患者血小板数量增多和血小板激活是两个值得重视的表现。肠道免疫系统紊乱能募集炎症细胞释放炎性介质，造成组织损伤和功能障碍，其中细胞黏附分子在肠道免疫反應与炎症进程中起到重要作用。E选择素和P选择素是细胞黏附分子中选择素家族的成员，免疫学者逐渐开始关注它们在UC发生发展进程中的作用。E选择素仅在激活的内皮细胞表达，由内皮细胞刺激产生，炎症因子白介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、细菌脂多糖（LPS）等刺激内皮细胞后，E选择素的表达显著增加。E选择素通过识别细胞特异性糖蛋白配体SleX、SleA介导细胞的早期黏附，从而介导白细胞在炎症部位聚集，促进炎症反应[2-3]。P选择素与溃疡性结肠炎关系密切[4]，P选择素参与启动早期炎症反应，同时它也是血小板活化的金标准及内皮细胞活化的重要指标[5]。炎症性肠病（IBD）活动期存在内皮细胞损伤和血小板活化，因此人们越来越重视P选择素在IBD病理过程中的作用[6]。在组织发生炎症时，白细胞等炎性细胞释放刺激因子诱导P选择素在血小板及内皮细胞上表达，而P选择素与PSGL-1有特殊的亲和力，又介导P选择素与中性粒细胞的黏附，促进炎症反应发生。本研究通过TNBS构建UC模型，ELISA法检测UC病损区E选择素、P选择素含量，进而探讨其在溃疡性结肠炎发病过程中的表达及意义，为指导临床UC的诊断、治疗提供新的思路。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取2018年3-6月健康的雄性SD大鼠65只，SPF级，体重180～250 g（购自齐齐哈尔医学院实验动物中心）饲养于通风、温暖、定时光照的环境下，专用全营养饲料及清洁水喂养。动物质量合格证编号：No.43004700032111;实验动物使用许可证号：SYXK（黑）2018-0012。

1.2 主要试剂和器材 TNBS试剂（批号SLBT1675）购于Sigma-Aldrich公司;E选择素试剂盒、P选择素受体试剂盒，均购于上海恒远公司;微型台式离心机（Thermo Electron Corporation美国）;切片机（Leica RM2255德国）;石蜡包埋机（Leica EG1150H德国）。

1.3 方法

1.3.1 造模 根据赵平等[7]方法进行造模，65只SD大鼠随机选取12只进行预实验，选取12只作为空白对照组，正常饲养，不做处理;剩余41只大鼠作为实验组，全部进行造模，造模前禁食不禁水48 h，经7%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔麻醉，向结肠灌注TNBS（100 mg/kg）与50%的乙醇0.25 mL组成TNBS-乙醇混合液。于灌胃器8 cm处标记刻度，由肛门轻缓插入至刻度线，匀速推药，之后将灌胃器缓慢旋出。为防药液外溢，采用头低尾高体位，轻提鼠尾倒置10 min，放回笼中待自然清醒。注意保暖，密切观察大鼠生理状态。

1.3.2 动物分组 造模后每天记录大鼠的活跃状况，第3天从可作为实验动物模型的鼠中，随机处死5只大鼠，对其进行解剖，观察结肠组织以确认UC大鼠模型的建立。对剩余36只大鼠从一编号到三十六，通过随机数字表抽三十六个数，按大小排序，依次每十二个数对应的大鼠为一组，以此随机分为A、B、C组，各12只，分别于造模后3、7、14 d处死。

1.3.3 标本制备 分别处死模型组A、B、C三组大鼠后，取肛门至盲肠末端的结肠段，清理肠系膜并吸干水分，便于肉眼观察结肠大体形态以及病理取材。

1.4 观察指标与判定标准 （1）疾病活动度（DAI）变化参考冯陈慧等[8]标准，进行DAI评分，DAI=（体重+大便形态+大便出血）/3，DAI分值越大，说明溃疡性结肠炎越严重。（2）肉眼观察结肠大体形态，并对结肠黏膜损伤指数（CMDI）进行评分，大鼠肠道无缩短，肠壁黏膜光滑，纹理清晰，肠壁厚度均匀，未见水肿、糜烂及溃疡计0分;大鼠肠管缩短，肠壁大片充血，黏膜纹理紊乱、肿胀，肠道内有橘黄色的黏性物质附着计1分;肠管明显缩短，肠壁大片充血，水肿，肠道表面有黑褐色膜状物附着，易于撕脱，膜状物质下可见糜烂的肠黏膜内为半成型稀便计2分;肠道内残留不成形稀便，肠管缩短僵硬，肠壁淤血情况好转，黏膜表面有颗粒感，肠道内有棕色膜状物质附着，其下可见明显溃疡形成，管腔内积气积便计3分，CMDI评分越高，说明溃疡性结肠炎越严重[9]。（3）剪取病变明显的结肠段标本用10%的福尔马林固定;常规石蜡包埋并经HE染色;观察结肠组织的病理学改变[7]。（4）ELISA检测UC大鼠肠黏膜组织中的的E选择素、P选择素水平。比较分析A、B、C三组大鼠CMDI、DAI评分以及UC大鼠肠黏膜组织中的E选择素、P选择素水平。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，组间比较采用t检验;多组间采用采用F检验;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠的DAI评分比较 对大鼠造模后状态进行观察，每天观察两次。空白对照组大鼠活跃，反应灵敏，进食正常，毛色光滑，排便正常。造模后实验A、B、C三组大鼠均出现少动，精神萎靡，进食减少，毛色不光滑，出现不同程度的腹泻，对各组大鼠进行DAI评分。其中空白对照组体重未变化，粪便形态正常，隐血阴性，DAI分数为0分。实验A组体重下降1%～5%，粪便形态松散，隐血阳性，平均DAI分数为（1.00±0.20）分。实验B组体重下降>15%，粪便为稀便，肉眼血便，平均DAI分数为（2.60±0.30）分。实验C组有12只大鼠，体重下降10%～15%，粪便形态松散，肉眼血便，平均DAI分数为（2.00±0.15）分。A组至B组大鼠症状逐渐严重，C组有好转趋势。

2.2 各组大鼠的CMDI评分比较 空白对照组大鼠肠道无缩短，肠壁黏膜光滑，纹理清晰，肠壁厚度均匀，未见水肿、糜烂及溃疡，CMDI分数为0分。实验A组可见大鼠肠管缩短，肠壁大片充血，黏膜纹理紊乱，肿胀，肠道内有橘黄色的黏性物质附着，肠道内残留不成形稀便，平均CDMI评分为（1.50±0.15）分;實验B组大鼠肠管缩短、僵硬，其肠壁内淤血情况好转，肠黏膜表面呈现颗粒感，肠道内有棕色膜状物质附着，其下可见明显溃疡形成，平均CDMI评分为（4.00±0.20）分。实验C组大鼠肠管明显缩短，肠壁大片充血，表面有黑褐色膜状物附着，膜状物质下可见糜烂的肠黏膜，平均CDMI评分为（3.00±0.30）分。由上述可知，CMDI评分随造模时间的变化先升高后下降，表明A组至B组结肠损伤程度逐渐严重，C组损伤程度减轻。

2.3 各组大鼠的病理分析 镜下可见空白对照组大鼠的结肠黏膜上皮完整，杯状细胞丰富，各层结构清晰，未见水肿、糜烂及溃疡，仅有少量淋巴细胞浸润;实验A组镜下可见肠黏膜的基本结构消失，杯状细胞减少，隐窝结构扭曲，黏膜下层见大量中性粒细胞浸润，肠壁水肿，可见出血病灶，肌层变厚;实验B组镜下可见黏膜隐窝上皮变性坏死，肠黏膜糜烂，肠壁坏死深达肌层，炎性细胞浸润肠壁全层，黏膜及腺体脱落形成大片溃疡并覆盖黑色坏死膜状物质，肠壁明显水肿;实验C组镜下可见黏膜下大量炎性细胞浸润，部分溃疡开始愈合，腺体间有纤维组织增生，表现为肉芽组织的生成。由此可得，实验A、B、C组大鼠表现为炎症随时间进展由逐渐加重至后期的趋于缓解。

2.4 各组间肠黏膜E选择素、P选择素含量比较 空白对照组、A、B、C组间的E选择素、P选择素含量比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。随病情由轻到重至恢复的过程中，A、B、C组中的E、P选择素含量均呈现先升高后下降的趋势。空白对照组与A、B、C组比较，A组与B、C组比较，B、C两组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。溃疡性结肠炎由逐渐严重至恢复的过程中，各实验组肠黏膜组织中的E选择素、P选择素水平均先逐渐升高随后下降，但C组含量仍明显高于A组。见表1。

3 讨论炎症性肠病发病具有明显的地域，欧美地区患病率最高[10]。UC的发病率为（9～12）/10万，患病率为（205～240）/10万[11]，自身免疫反应为该病的重要发病机制，现已有研究表明E选择素和P选择素与UC的发病关系密切。

本实验通过疾病活动度（DAI）、结肠黏膜损伤指数（CMDI）进行疾病评分，综合病理损伤程度对溃疡程度进行分级，分为轻度、中度、重度，根据不同程度的溃疡与E选择素和P选择素含量的关系得出它们的相关性。与模型组对比，造模各组大鼠出现不同程度的精神不佳，稀便，体重下降等症状，结肠病损部位出现不同程度的损伤;比较实验组之间的病情变化，第3～7天逐渐加重，至第14天病情出现好转。

E选择素在血管内皮细胞上特异表达，身体处于健康状态时，处于极低水平，当机体存在疾病时，损伤区域E选择素含量升高，可以增加血管表面通透性，促进炎症细胞活化，介导炎症发生[12]，有研究表明，E选择素在UC发病过程中水平升高，提示在UC发病过程中发挥了重要作用[13]。本实验在大鼠溃疡性结肠炎发病的不同时期，对肠黏膜组织的E选择素水平进行测定，结果发现随着实验组大鼠溃疡性结肠炎由轻度逐渐加重的过程中，炎症区肠黏膜中E选择素的含量先明显升高，随着E选择素浓度降低，UC出现了转归，表明E选择素在病损区的浓度同病情发展呈正相关性。与郑煜凯等[14]研究成果相符，实验证明了E选择素在溃疡性结肠炎的发病过程中可能起到了促进UC病情发展的作用。因此E选择素对于临床诊断疾病发生发展，以及临床研究UC发病原理都有重要意义。

P选择素是一种广泛表达于血管内皮细胞表面的细胞黏附分子受体，研究发现其与炎症和肿瘤转移有关系密切[15]。P选择素在机体无炎症反应时基本不表达，当组织受损或炎症侵袭时，白细胞等炎性介质诱导在内皮细胞和血小板表面表达P选择素，且血小板活化可释放多种炎性因子，参与局部炎症反应，并导致白细胞向局部炎症累及部位趋化聚集，呈持续恶性循环[16-18]，据研究显示，发现IBD患者周围血中血小板表达P选择素增高，且IBD患者肠黏膜经超声破碎后上清液中P选择素的含量显著增高[19]。杨权等[20]研究表明活动期UC患者血浆P选择素明显高于健康人及缓解期患者，与疾病发展关系密切。本实验结果显示，随着溃疡性结肠炎逐渐加重至出现好转的过程中，实验组肠黏膜的P选择素水平从A组至B组升高，B组至C组少量降低，表明P选择素水平同病情表现呈正相关性，与杨权等[20]研究结果吻合，进一步证明了在UC发展过程中由于P选择素的增加，促进了炎症的发生发展过程。溃疡性结肠炎作为一种具有癌变可能的肠道疾病，研究P选择素在UC发生发展中的作用对临床治疗溃疡性结肠炎以及预防结肠癌变有重要意义。

综上所述，本实验进一步证明了随着溃疡性结肠炎病情逐渐严重，P选择素、E选择素于病损区浓度升高，随疾病转归，浓度随之降低。这对判断溃疡性结肠炎病情严重程度，提供了新的参考指标，也为今后进一步探索溃疡性结肠炎的发病机制和治疗提供了新的思路。

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（收稿日期：2018-10-19） （本文编辑：李莹莹）