Myogenin 在不同发育阶段小鼠骨骼肌中的表达差异

任华伟，薛霖莉，2，曹 靖，李艺雷，冀云燕，罗小毛，于秀菊，赫晓燕，王海东

（1.山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801；2.山西农业大学信息学院，山西太谷030800；3.北京农业职业学院畜牧兽医系，北京102442）

MyoD 家族是近年来分子生物领域的研究热点和前沿，目前已知成员包括MyoD、Myogenin、Myf5、Myf6。MyoD 家族成员的氨基酸序列的同源性高达80%，它们都有68 个残基的同源片段[1-3]；其可激活静止状态的肌肉特有基因，并与增强子结合进而促进转录、促进某些细胞向骨骼肌分化[4]。不仅是骨骼肌的生长发育，在骨骼肌受损后肌纤维的修复过程中该家族也起着重要作用。

Myogenin 是MyoD 家族中的重要成员之一，在敲除Myogenin 基因的研究中，小鼠肌组织生成的成肌细胞数量不会改变，但其却不能分化为肌细胞[5-6]，说明成肌细胞向成熟肌纤维分化过程中Myogenin起了主导作用。

NCVILLLC 等[7]在去神经造成的骨骼肌MRFS基因转录增强效果的试验研究中发现，Myogenin 基因的反应很快并且增幅很高，其为MyoD 家族中在全部骨骼肌的细胞系中均能表达的唯一成员。HASTT 等[8]在小鼠Myogenin 蛋白消除试验中表明，Myogenin 蛋白在肌细胞的分化过程中起主要调控的作用，是骨骼肌分化的必需因子，其作用不能被其他肌源性调节因子所代替。有研究结果表明，在力竭游泳实验恢复的不同时期及肌肉损伤后的不同时期，骨骼肌成肌调节因子Myogenin 蛋白表达呈现规律性变化[9]，表明Myogenin 因子在此过程中具有重要的作用，可作为一项重要的医学观测指标，因此研究其在不同月龄小鼠的骨骼肌中的表达在治疗肌肉疾病中具有重要的意义。此前，有学者研究Myogenin 基因在五指山猪与长白猪骨骼肌当中的表达对肉猪发育产量的影响，结果表明，Myogenin 基因不但影响骨骼肌表达的特异表型，而且还会对猪肉的产量和品质造成显著影响[10]。TE 等[11]对14 199 个样本Myogenin 基因3′端进行检测发现，Myogenin 基因型对初生质量、日增质量、酮体质量及瘦肉率具有明显的影响。对Myogenin 基因的深入研究将有助于推动当前养殖行业的发展与进步。

基于此前学者对Myogenin 的研究进展发现，有关动物机体肌肉发育与该基因表达变化之间的关系目前尚无人研究。

本试验以处于幼年、性成熟、体成熟以及老年4 个不同发育阶段的小鼠为研究对象，通过采用H.E.染色、组织化学免疫技术及荧光定量PCR 技术研究Myogenin 基因在小鼠骨骼肌中的表达差异，旨在对之后进一步研究动物骨骼肌生长发育机制提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验动物

随机选取品系为C57BL/6J 的健康小鼠（购于北京维通利华实验动物技术有限公司），包含1 周龄幼鼠、3～4 周龄性成熟小鼠、6～8 周龄体成熟小鼠和8 月龄老年鼠各3 只。采用断颈法处死小鼠，分别取其两侧骨骼肌，其中，左侧采用Bouin's固定液进行固定，24 h 后采用梯度酒精和二甲苯进行脱水透明，制作成厚度为6 μm 的组织切片用作之后H.E.的染色和免疫组织化学试验；右侧即刻置于液氮内进行冷冻保存，用作提取总RNA 以及总蛋白。

1.2 试剂与仪器

试验所用试剂和仪器列于表1。

表1 试验试剂及试验仪器

1.3 试验方法

1.3.1 H.E.染色 将不同生长周期小鼠的骨骼肌组织块用Bouin's 液固定后处理并切片，利用二甲苯和由高到低的梯度酒精脱蜡，苏木精染核40 s 后用蒸馏水返蓝，用由低到高梯度酒精脱水至90%，利用伊红进行细胞质着色5～10 s，光学显微镜下观察染色情况，继续脱水至无水酒精，并用二甲苯进行组织透明，最后中性树脂封片。

1.3.2 免疫组织化学试验 将幼年、性成熟、体成熟和老年小鼠骨骼肌的石蜡切片用二甲苯和梯度酒精脱蜡处理，在组织上滴加solution A，37 ℃恒温箱反应10 min 封闭内源性过氧化物酶；使用PBS缓冲液冲洗3 次；滴加封闭液solution B，然后置于恒温箱10 min；阳性滴加一抗（MyoG 抗体和PBS 缓冲液以1∶30 比例配制），阴性滴加PBS 对照，4 ℃孵育14 h 后，37 ℃恒温箱复温30 min，用PBS 缓冲液冲洗3 次，滤纸吸去切片组织周围液体，滴加二抗（solution C），恒温箱中静置孵育30 min；同样滤纸吸去组织周围液体，滴加solution D，恒温箱中反应10 min，用PBS 缓冲液冲洗3 次，滤纸吸去组织周围液体，滴加DAB 显色剂，保持避光，当观察到组织变色并不再加深时，用PBS 冲洗3 次，用苏木精染核3 min，蒸馏水冲洗3 次。使用梯度酒精和二甲苯脱水透明，最后用中性树脂进行封片。

1.3.3 总RNA 的提取 在液氮条件下快速将组织块研磨成粉末并移入1 mL 的Trizol 裂解液中混匀。加入200 μL 氯仿，混合至溶液呈现乳粉色，冰上静置5 min，12 000 g 4 ℃离心15 min 可见溶液分层，上层为含有RNA 的无色上清水样层，中层含有白色蛋白质和DNA，下层为带有颜色的有机相。缓慢吸取上清液移入新离心管中，加入500 μL 异丙醇，混匀后冰上静置10 min，12 000 g 4 ℃离心10 min，弃上清，加入1 mL 的70%冰乙醇上下颠倒充分洗涤离心管管壁，7 500 g 4 ℃离心5 min 后尽量弃去上清液，小心吸去残液并快速干燥几分钟，用适量的DEPC 水溶解RNA 沉淀，离心混匀后用核酸浓度检测仪测定总RNA 浓度以及OD260/OD280值。

1.3.4 反转录 将提取的总RNA 稀释至1 000 ng/μL 备用，通过2 步法进行反转录：第1 步，去除基因组DNA。加入2 μL 5×g DNA Eraser Buffer、1 μL gDNA Eraser 和1 μL RNA 样品，RNAse Free H2O 补充至10 μL体系，PCR 仪中42 ℃反应2 min。第2 步，反转录，基于第1 步反应体系，加入1μL 的Rrime Scripe RTEnzyme MixⅠ、1 μL 的RT Rrime mix、4 μL的5×prime scripe Buffer 2 以及4 μL RNAse Free H2O 将体系补充至20 μL，PCR 仪中37 ℃15 min、85 ℃5 s。反应结束后，测定cDNA 浓度，并稀释至100 ng/μL 备用。

1.3.5 普通PCR 通过普通PCR 测定目的Myogenin 引物的最适扩增温度，其体系列于表2。

表2 普通PCR 体系（10 μL）

设置8 个温度梯度：53，54，55，56，57，58，59，60 ℃。梯度PCR 仪设置变性、退火、延伸3 个环节，共扩增40 个循环，反应条件为：95 ℃起始5 min；95 ℃变性30 s，53～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s；72 ℃终延伸5 min。120 V 电压进行琼脂糖凝胶电泳20 min，通过紫外透视仪和相应软件AlphaEase-FC 观察比对，从而确定Myogenin 引物的最佳退火温度。

1.3.6 实时荧光定量PCR 根据GenBank 录入的Myogenin 基因序列的保守区域，运用Primer 5.0 软件设计小鼠Myogenin 基因的特异性引物以及内参引物β-Actin（华大基因公司合成），引物序列列于表3。通过实时荧光定量PCR 检测，对起始模板进行定量和定性分析，反应体系列于表4。

表3 目的基因及内参基因引物序列

表4 荧光定量PCR 体系（10 μL）

2 结果与分析

2.1 不同发育阶段小鼠骨骼肌的形态特征

H.E.染色的切片在光学显微镜下进行观察并拍照，结果发现，幼年期与性成熟时期的小鼠骨骼肌细胞间隙较小，肌纤维排列紧密，年龄越小的小鼠骨骼肌细胞胞核越多，并且多见中央核，随着年龄的增长，老年小鼠的肌细胞间隙明显增宽，肌纤维排列疏松，肌束间隙明显增大，细胞核稀少并逐渐边缘化（图1）。

2.2 不同发育阶段小鼠骨骼肌中Myogenin 的表达定位

将免疫组织化学切片放置在显微镜下观察并拍照，可见滴加一抗的阳性组与阴性组有明显不同，其中，阳性组细胞胞核呈现蓝紫色，其胞质有明显黄染；阴性组骨骼肌组织未见此反应。通过免疫组织化学染色可以看出，Myogenin 在小鼠骨骼肌的4 个发育阶段均有表达，且在幼年和性成熟时期表达量较体成熟期和老年时期要高，其表达位置为细胞质（图2）。

2.3 Myogenin mRNA 在不同发育阶段小鼠骨骼肌中的表达差异分析

2.3.1 Myogenin 在不同发育阶段小鼠骨骼肌中的表达 提取出的总RNA 经过DEPC 水溶解后用核酸浓度检测仪进行监测，其结果列于表5。

表5 总RNA 的浓度及OD260/OD280 值

经过PCR 仪将RNA 反转录为cDNA 后，用核酸浓度检测仪测定cDNA 的浓度，其结果列于表6。

表6 cDNA 的浓度及OD260/OD280 比值

根据琼脂糖凝胶电泳试验结果（图3），第8 条带清晰明显，并且无拖尾现象，可以确定Myogenin的最佳退火温度为60 ℃。

2.3.2 Myogenin mRNA 在不同发育阶段小鼠骨骼肌中的表达差异 根据Myogenin 基因和内参基因的溶解曲线可知（图4），该定量PCR 结果具有特异性，从扩增曲线来看，目的基因从第24 个循环开始扩增，内参基因从第14 个循环开始扩增，在扩增过程中有较为一致的上升期和平台期，根据该曲线得出的CT 值，由2-ΔΔCT法计算出目的和内参基因在不同发育阶段小鼠骨骼肌中的相对表达水平，结果显示，体成熟和老年小鼠骨骼肌组织中Myogenin 的表达量与幼年小鼠相比呈现极显著差异（P＜0.01），随着小鼠发育成熟，Myogenin 在小鼠骨骼肌组织中表达水平基本呈现下降趋势，幼鼠表达量极高，老年鼠表达量最低，表明Myogenin 与骨骼肌的成熟发育相关（图5）。

3 结论和讨论

骨骼肌是由具有收缩能力的肌细胞组成，它是动物机体中最大的肌肉组织、不分支，并且有明显的横纹。随着分子生物学的发展及基因敲除技术和基因打靶技术的进步，人们对骨骼肌的生长与发育在分子水平上有了更加深入的了解[12-14]。有后肢悬垂对Myogenin 基因影响的研究[15]、运动状态对Myogenin 的影响研究[16]；曾缨等[17]研究认为，Myogenin 基因在不同月龄的DMD 模型鼠身上的表达，Myogenin 在1 月龄的mdx 小鼠身上表达最强烈，13 月龄仍有表达，但正常C57 鼠几乎不表达[17]。这些研究表明，Myogenin 基因表达量不仅与其运动状态、病理状况、张应力及乙酰胆碱刺激等影响有关，更与机体的发育阶段相关。

本试验分别提取了幼年时期、性成熟时期、体成熟时期以及老年时期4 个有代表性的不同发育阶段小鼠骨骼肌组织，通过H.E.染色、免疫组化及定量PCR 观察Myogenin 基因的表达水平。有学者研究生长激素对骨骼肌细胞形态的影响，在注射生长激素8 周后，骨骼肌纤维排列松散，细胞核数量减少且体积变小[18]。通过H.E.染色的切片结果可以看出，肌肉由数量不等的肌束构成，H.E.染色切片空白的间隙即为肌束膜，是由含有血管和神经的结缔组织构成。通过不同发育阶段的小鼠腓肠肌H.E.染色切片对比可以看出，幼年和性成熟时期的肌束间隙比较小，肌束较为紧密，而体成熟和老年时期的骨骼肌肌束稀少并且间隙比较宽大，细胞核数目也明显减少，研究结果与前人研究结果吻合。廖艳萍[19]对发育期小鼠大强度离心运动对Myogenin 基因表达影响的研究表明，该基因在幼年期小鼠骨骼肌有表达，达雨等[20]对功能矫形对青春期小鼠Myogenin 表达影响的研究表明，该基因在性成熟及体成熟时期有表达。本试验通过免疫组织化学试验的切片可以看出，Myogenin 基因在4 个不同的发育阶段均有表达，说明Myogenin 基因贯穿了动物体发育的一生，是骨骼肌发育所必需的，与其结论基本一致。有试验表明，Myogenin 基因表达与动物年龄有关，孙伟等[21]对Myogenin 基因不同日龄的湖羊背最长肌中的表达进行研究，结果发现，年龄对Myogenin 基因在湖羊背最长肌中的表达有显著影响，且幼年的湖羊Myogenin 基因表达量最高。通过定量PCR 试验结果可以看出，Myogenin 基因在幼年时期表达量极高，与其他发育时期相比具有显著差异。表明肌肉在幼年时期发育分化最快，与已有研究结果基本一致。小鼠骨骼肌Myogenin 的表达量与其发育时期密切相关，且在幼年时期表达量最高。

本研究结果表明，Myogenin 基因在幼年、性成熟、体成熟和老年时期4 个阶段的小鼠骨骼肌中均有表达，且表达位置是细胞质。Myogenin 基因在这4 个阶段的表达量具有显著差异，且在幼年时期小鼠骨骼肌的表达量极高，在性成熟时期小鼠骨骼肌中的表达量减少不明显，而在体成熟期和老年时期小鼠骨骼肌中的表达量显著减少。