几种天然抗氧化剂对牡丹籽油氧化稳定性的影响

刘 普 张丽娜 张江磊 王 玉 刘梦梦 许世靖 乔明明 邓瑞雪

(河南科技大学化工与制药学院;洛阳市天然产物功能因子研究及产品开发重点实验室，洛阳 471023)

牡丹籽油是一种新开发的食用油脂，含有丰富的不饱和脂肪酸，具有较好营养价值，被认为是植物油中的珍品[1-5]。目前，经国家卫生部批准可以作为牡丹籽油制备原料的油用牡丹仅有凤丹牡丹(Paeoniaostii)和紫斑牡丹(P.rockii)2个品种[1,6]。我国食用油资源相对短缺，食用油对外依存度已超过60%[7]，因此研究开发新的食用油脂资源对于维护国家的粮油安全具有重要意义。我国油用牡丹资源丰富，山东菏泽、河南洛阳、四川彭州、安徽亳州和铜陵、甘肃临夏以及湖南湘西等地均有大面积的油用牡丹种植，且种植面积在逐年增大[8]。作为一种新型的木本油料作物，油用牡丹的广泛种植和应用可以在一定程度上缓解我国食用油资源短缺的现状。

牡丹籽油中的不饱和脂肪酸含量约占总脂肪酸含量的90%，可以满足人体对不饱和脂肪酸的需求[9-10]。但不饱和程度过高，也导致了牡丹籽油在生产和贮存过程中容易受到光、热、氧气等作用而发生氧化性酸败，致使其本身风味和营养价值遭到破坏[11]。目前，关于牡丹籽油天然抗氧化剂的系统研究开发的文献较少[11]。研究牡丹籽油在加工和贮存过程中氧化稳定性问题是牡丹籽油研究开发应用的前提，对于牡丹籽油相关深加工产品深入研究开发具有重要意义。

以天然食品抗氧化剂取代化学合成抗氧化剂是今后食品抗氧化剂工业发展的趋势，开发实用、高效、成本低廉的天然抗氧化剂仍是重要的研究方向。对于抗氧化活性成分及其效果，各抗氧化活性之间协同作用，以及抗氧化机制、化学结构与抗氧化性及稳定性的相关性等的研究将是未来研究的重点[12]。我国有着非常丰富的天然抗氧化剂资源，多酚类物质作为天然抗氧化剂显示了良好的应用范围，天然食品抗氧化剂将有广阔的应用前景。

本研究采用Schaal烘箱耐热试验法，以人工合成抗氧化剂二叔丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚和特丁基对苯二酚为阳性对照，研究分析了几种天然抗氧化剂及增效剂对牡丹籽油氧化稳定性的影响，比较了不同抗氧化剂之间的复合抗氧化作用效果。并根据范特霍夫规则，对牡丹籽油在20 ℃条件下的储存时间进行了预测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

油用牡丹籽采自洛阳市嵩县车村镇油用牡丹种植基地，原植物为凤丹牡丹(Paeoniaostii)。凤丹牡丹籽脱壳后得牡丹籽仁，经机械压榨法制备牡丹籽油，保存于-20 ℃的冰箱中，备用。

磷酸、浓盐酸、硫酸锂、苯甲酸、磷酸二氢钾、钨酸钠、无水碳酸钠、溴素、磷酸、磷钼酸、冰乙酸、碘化钾、柠檬酸(CA)、钼酸钠、氯仿等试剂均为分析纯。

脂溶性迷迭香、水溶性迷迭香、茶多酚、苹果多酚、葡萄多酚、维生素C(VC)、没食子酸、生育酚、BHT、BHA、TBHQ、牡丹籽多酚、野葡萄籽多酚。

1.2 仪器与设备

UV-2600-PC 紫外-可见分光光度计；HANGPING FA2004电子天平；BPH-9082精密恒温培养箱；UV-1800型紫外分光光度计；ULUP-III-10T优普系列超纯水器。

1.3 方法

1.3.1 多酚类化合物含量测定

采用Folin-Ciocalteu试剂法[13-14]来测定天然抗氧化剂中的多酚类化合物的含量。以没食子酸为标准品，检测波长为750 nm。以没食子酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程。

分别取一定量的天然抗氧化剂，用甲醇溶解，配成一定浓度的储备溶液。分别取储备液1.0 mL到100 mL的容量瓶中，各加入60 mL水，再加入5 mL Folin-Ciocalteu试剂，混合均匀，然后再分别加入15 mL 20%碳酸钠溶液，加水定容。将混合溶液在20 ℃放置30 min后，在波长为750 nm下测定吸光度值，由标准曲线计算出天然抗氧化剂中多酚类化合物相当于没食子酸的量。

1.3.2 牡丹籽多酚的制备

由于油用牡丹籽壳中含有丰富的多酚类化合物，具有较好的抗氧化活性作用[15-16]。本实验将油用牡丹籽壳多酚作为一种天然抗氧化剂来应用。

取本实验研究中脱壳得到的油用牡丹籽壳，粉碎，加入10倍质量的体积份数为95%乙醇，在50 ℃的条件下超声提取20 min。回收提取液，减压浓缩得浸膏。将浸膏用100倍质量的水充分溶解，过滤，滤液用大孔吸附树脂充分吸附，装柱，先用水洗脱，再用10%、30%、50%、70%、90%的乙醇分别洗脱，测定各洗脱液多酚含量。收集多酚含量最高的馏分段，减压蒸馏，即牡丹籽壳多酚提取物，备用。

1.3.3 野葡萄籽多酚的制备

野葡萄也含有较多的多酚类化合物。由于豫西伏牛山区野葡萄资源丰富，具有较大的研究开发价值。本实验将野葡萄籽多酚也作为一种天然抗氧化剂应用。

取野葡萄(VitispiasezkiiMaxim)籽，采用压榨法去除其中所含的油脂。将榨油后剩余的籽饼粕干燥至恒重，粉碎，加入10倍质量的体积份数为95%乙醇，在50 ℃的条件下超声提取20 min。回收提取液，减压浓缩得浸膏。将浸膏用100倍质量的水充分溶解，过滤。滤液用大空吸附树脂充分吸附，装柱，先用水洗脱，再用10%、30%、50%、70%、90%的乙醇分别洗脱，测定各洗脱液多酚含量。收集多酚含量最高的馏分段，减压蒸馏，即野葡萄多酚提取物，备用。

1.3.4 过氧化值的测定─碘量法

参考GB/T 5009.37—2003《动植物油脂过氧化值测定》的国家标准。

1.3.5 货架寿命预测

由范德霍夫规则[17]可知，化学反应速率受温度影响，且温度每升高10 ℃，反应速率提高2～4倍，即K(T+10)/K(T)=γ(2～4)，而食品货架寿命(S)与反应速率常数K成反比，即K越大，货架寿命越小，S(T)/S(T+10)=γ(2～4)，由γ=2可得出表1的相关数据。

表1 温度与货架寿命系数关系

由表1可知，采用Schaal烘箱法在60 ℃实验时，实验1 d相当于20 ℃下贮藏的16 d，据此可预测牡丹籽油的保存时间。

1.3.6 单一抗氧化剂对牡丹籽油氧化稳定性的影响

根据相关文献报道[18]，按照各抗氧化剂的0.02%添加量，准确称取各抗氧化剂：水溶性迷迭香提取物、脂溶性迷迭香提取物、野葡萄籽多酚、葡萄多酚、牡丹籽多酚、茶多酚、苹果多酚、BHT、BHA、TBHQ和生育酚等于样品瓶中，然后在各个瓶中加入少量无水乙醇溶解抗氧化剂，接着加入63 mL牡丹籽油，超声，使抗氧化剂均匀地分散于油脂中。以未添加抗氧化剂的等量油样做空白对照，置于60 ℃精密恒温培养箱中保存。定期测定油样的POV值，每次测量前充分摇匀油样，测量后交换样品在培养箱中的位置。比较在相同添加浓度下，不同天然抗氧化剂在牡丹籽油中的抗氧化效果。

在对式(3)进行OLS估计时，如果序列是非平稳的，则可能导致“伪回归”。Engle和Granger (1987)提出的单方程线性协整模型较好地解决了这一问题，其形式如下：

将本步骤中的不同抗氧化剂分别加入0.02%维生素C和0.02%柠檬酸，其他处理步骤同上，考察增效剂对抗氧化剂作用效果的影响。

1.3.7 复合天然抗氧化剂对牡丹籽油氧化稳定性的影响

文献报道显示，复合抗氧化剂的抗氧化效果一般较单一抗氧化剂要好[19-20]。为了进一步提高抗氧化剂对牡丹籽油的抗氧化能力，将抗氧化作用效果较好的天然抗氧化剂：葡萄多酚、牡丹籽多酚、茶多酚、苹果多酚、生育酚、脂溶性迷迭香等分别两两复合后添加到牡丹籽油中，研究抗氧化剂复合后对牡丹籽油氧化稳定性的影响。复合抗氧化剂的添加总量为牡丹籽油质量的0.02%(每个复合抗氧化剂的添加量均为0.01%)，按照步骤1.3.6操作进行抗氧化实验。

在本步骤中的不同复合天然抗氧化剂再分别加入0.02%维生素C和0.02%柠檬酸，其他处理步骤同上，考察增效剂对复合抗氧化剂作用效果的影响。

1.3.8 天然抗氧化剂与合成抗氧化剂复合对牡丹籽油氧化稳定性的影响

在合成抗氧化剂TBHQ中加入对牡丹籽油抗氧化作用效果较好的天然抗氧化剂：葡萄多酚、牡丹籽多酚、茶多酚、苹果多酚、生育酚、脂溶性迷迭香等，考察TBHQ复合天然抗氧化剂对牡丹籽油氧化稳定性的的影响。复合抗氧化剂的总用量控制在牡丹籽油质量的0.02%左右(TBHQ和天然抗氧化剂含量均为0.01%)，按照步骤1.3.6操作进行抗氧化实验。

2 结果与讨论

2.1 没食子酸标准曲线绘制

对照品标准曲线如图1所示，曲线的回归方程为：

Y=0.093 09X+0.005 34，R2= 0.999 4

图1 没食子酸标准曲线

方程表明，标准品质量浓度在0.05～3.5 μg/mL的范围内呈线性关系。不同类型的天然抗氧化剂的多酚含量测试结果如图2所示。

图2 不同类型的天然抗氧化剂多酚含量

由图2所示，不同类型的天然抗氧化剂中多酚类化合物的含量不同，其中茶多酚含量最高，质量分数为70.79%，其次为苹果多酚和葡萄多酚，质量分数分别为65.36%和57.87%。含量较低的为脂溶性迷迭香和水溶性迷迭香，质量分数分别为18.69%和23.76%。由图2可以看出，不同天然抗氧化剂中多酚类化合物的含量不同。

2.2 单一天然抗氧化剂对牡丹籽油氧化稳定性的影响

由图3可以看出，所有油样的过氧化值均随着贮藏时间的增加而增大，也就是说贮藏时间越长，牡丹籽油的氧化酸败程度越大。添加抗氧化剂后，牡丹籽油样品的POV值明显低于空白对照组，说明氧化剂的加入可以有效延缓牡丹籽油的氧化酸败。

图3 单一抗氧化剂对牡丹籽油抗氧化效果影响

几种抗氧化剂对牡丹籽油抗氧化作用效果依次为：TBHQ>脂溶性迷迭香提取物>茶多酚>葡萄多酚>苹果多酚>牡丹籽多酚>BHT>水溶性迷迭香提取物>野葡萄多酚>BHA>VE。研究发现，几种天然抗氧化剂在牡丹籽油中的抗氧化活性作用均弱于常用的油脂抗氧化剂TBHQ，其中脂溶性迷迭香提取物表现出较强的抑制牡丹籽油的氧化作用，其作用效果与合成抗氧化剂TBHQ接近，强于合成抗氧化剂BHA和BHT的作用效果，与文献报道的数据一致[21]。另外，茶多酚，葡萄多酚，苹果多酚，牡丹籽多酚均表现出较好的抑制牡丹籽油氧化作用效果，抗氧化作用效果均强于合成抗氧化剂BHA和BHT。结合图2中不同抗氧化剂多酚含量的测定结果，可以看出茶多酚，葡萄多酚，苹果多酚，牡丹籽多酚等在牡丹籽油中的抗氧化作用效果与其多酚含量有非常密切的关系，多酚含量越高，抗氧化能力越强。这也说明了这几种抗氧化剂中多酚类化合物是其具有较好抗氧化作用的主要活性物质。迷迭香中除了含有多酚类化合物外，还含有多种有机酸和萜类等活性成分[22]，因此尽管迷迭香中多酚含量并不高，但却表现出较好的抗氧化作用。脂溶性迷迭香对牡丹籽油的抗氧化作用强于水溶性迷迭香，可能是由于水溶性迷迭香在牡丹籽油中的溶解性相对较小，从而导致抗氧化活性作用降低。野葡萄籽提取物在牡丹籽油中的抗氧化作用相对较弱，可能与其提取物中较低的多酚含量有关。

另外，研究发现，当添加了VE后，牡丹籽油的POV值高于空白对照组的POV值，这说明VE在本实验中对牡丹籽油的氧化酸败有一定的促进作用，可能是由于牡丹籽油中含有一定量的VE，VE的加入使牡丹籽油中的VE含量过高所致。所以在选择VE作为牡丹籽油的抗氧化剂时，一定要注意加入量，过量的VE对油脂的氧化具有一定的促进作用，会影响抗氧化作用效果[17,23]。

2.3 天然抗氧化剂加增效剂对牡丹籽油氧化稳定性的影响

增效剂维生素C和柠檬酸对天然抗氧化剂抗氧化作用效果影响见图4所示。从图4可以看出，添加了增效剂维生素C和柠檬酸后，各抗氧化剂在牡丹籽油中的抗氧化活性作用效果均有提高。说明增效剂对天然抗氧化剂和合成抗氧化剂均可以起到较好的增效作用。增效剂对抗氧剂的作用效果并不完全相同，其中维生素C的增效效果要强于柠檬酸，这可能与柠檬酸和维生素C不同的协同抗氧化作用途径有关。柠檬酸和维生素C均可以螯合油脂中的金属离子，通过使金属离子钝化来达到抑制油脂氧化的目的。另外，柠檬酸还可以通过使酚类抗氧化剂氧原子上不成对的单电子与苯环上的π电子云发生共轭作用，使不成对单电子分散到苯环上，从而降低了体系自由基的能量，形成相对稳定的结构，油脂氧化的链式反应中断，从而提高了抗氧化能力[11]。而维生素C本身就是抗氧化剂，可以通过捕获油脂氧化过程中产生的自由基和降低油脂中活性氧的浓度来阻断油脂氧化的自由基链式反应[24]。

图4 添加增效剂对牡丹籽油抗氧化效果影响

2.4 复合抗氧化剂对牡丹籽油氧化稳定性的影响

不同类型的抗氧化剂复合后对牡丹籽油抗氧化作用效果见图5所示。由图5可以看出，添加了复合抗氧化剂后，牡丹籽油的氧化稳定性明显提高，复合后抗氧化剂发挥了较好的抗氧化作用效果。添加了0.01%脂溶性迷迭香+0.01%葡萄籽多酚和0.01%脂溶性迷迭香+0.01%茶多酚的牡丹籽油的过氧化值最小，表明脂溶性迷迭香与葡萄籽多酚和茶多酚的复合作用效果最好，明显强于其他各组的复合效果，且复合后抗氧化作用效果与合成抗氧化剂TBHQ相当。同样，与脂溶性迷迭香复合后，牡丹籽多酚的抗氧化作用效果也明显增强。

图5 复合天然抗氧化剂对牡丹籽油抗氧化效果影响

抗氧化剂复合后的协同作用可能与不同类型的抗氧化活性物质的抗氧化作用机制有关[25]。本研究采用的几种天然抗氧化剂中主要活性成分差异较大，脂溶性迷迭香的抗氧化活性物质是以鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酚等为代表的二萜酚酸和以迷迭香酸为代表的羟基苯丙酸类化合物[22]；葡萄籽多酚由酚酸类、儿茶素类、花色苷类、黄酮醇类和缩聚单宁等物质组成，其中以花色苷的含量最为丰富，可以达到80%～85%，其他成分如儿茶素和表儿茶素的含量次之，大约为5%[26]；茶多酚是茶叶中多酚类物质的总称，包括儿茶素类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等，主要为儿茶素类，占60%～80%[27]；牡丹籽多酚主要为低聚茋类化合物[15-16]。不同类型的活性成分可能有不同的抗氧化作用机制，复合后会产生一定的协同抗氧化作用效果[28-29]。

图6 复合天然抗氧化剂添加增效剂后对牡丹籽油抗氧化效果影响

同时，从图6可以看出，增效剂的加入同样可以起到增强复合抗氧化剂的抗氧化作用效果的目的。

2.5 天然抗氧化剂对合成抗氧化剂TBHQ的增效作用

脂溶性迷迭香提取物、茶多酚、葡萄多酚、苹果多酚和牡丹籽多酚等5种天然抗氧化剂对合成抗氧化剂TBHQ的协同及增效作用结果见图7所示。

图7 复合天然抗氧化剂与TBHQ后对牡丹籽油抗氧化效果影响

从图7可以看出，天然抗氧化剂添加到TBHQ中后，在牡丹籽油中的抗氧化活性均大于添加量为0.01%的TBHQ的抗氧化活性作用，表现出较好的增效作用。表明天然抗氧化剂对合成抗氧化剂也具有较好的协同增效作用。因此，在应用合成抗氧化剂的时候可以适当添加一些具有协同作用的天然抗氧化剂，这样不仅可以降低合成抗氧化剂的用量，减少合成抗氧化剂由于潜在毒性和副作用等缺陷带来的食品安全问题，还可以更好发挥天然抗氧化剂的保健优势[12]。

2.6 牡丹籽油货架寿命的预测

国标规定，食用植物油脂POV值应该小于或等于6 mmol/kg。表2数据给出牡丹籽油在60 ℃条件下的储藏时间，由此即可预测出牡丹籽油在20 ℃条件下的保存时间，其结果如图8所示。

表2 60 ℃牡丹籽油的储藏实验

注：横坐标序号代表的抗氧化剂与表2对应一致。图8 抗氧化剂与牡丹籽油储存时间的关系

由图8可知，未添加抗氧化剂的牡丹籽油，60 ℃加速氧化条件下的储存期为2.5 d，而添加FSR+TP+VC和FSR+TP+CA实验组的储存期分别为6.51 d和6.45 d，添加这两种复合抗氧化剂可使牡丹籽油在20 ℃条件下的货架寿命从40 d延至超过103 d，抗氧化作用效果与TBHQ非常接近。

3 结论

在国家允许添加量范围内，几种天然多酚抗氧化剂均能提高牡丹籽油的氧化稳定性，但单独使用的效果要弱于人工合成抗氧化剂。维生素C与柠檬酸是抗氧化剂的良好增效剂，协同抗氧化作用显著，且维生素C的效果优于柠檬酸。在牡丹籽油体系中，脂溶性迷迭香提取物抗氧化效果较为理想，与合成抗氧化剂TBHQ效果接近。复合抗氧化剂的抗氧化效果优于同等质量浓度的单一抗氧化剂，复合添加0.01%茶多酚+0.01%脂溶性迷迭香+0.02%维生素C、0.01%苹果多酚+0.01%牡丹籽多酚+0.02%VC和0.01%茶多酚+0.01%脂溶性迷迭香+0.02%柠檬酸均能显著减缓牡丹籽油的氧化速度，使牡丹籽油的贮藏时间明显延长。