焙烤类谷物食品糖基化产物的定性、定量评价方法

樊 蕊

(北京大学公共卫生学院营养与食品卫生学系，北京 100191)

美拉德反应是一种广泛存在于食品加工储藏等过程中的非酶糖基化反应，也称为“非酶褐变”或“羰氨反应”。非酶糖基化反应是还原糖如葡萄糖、果糖等与蛋白质游离氨基之间发生的可逆反应[1]，生成Schiff碱，Schiff 碱经过分子重排形成结构相对稳定Amadori 产物。Amadori 产物再经过一系列化学反应，包括多重脱水、裂解及活性二羰基中间产物的氧化修饰，形成多样、稳定的加合物，即晚期糖基化终产物(Advanced glycation end-products, AGEs)[2]。AGEs 有多个生成来源和机制，如葡萄糖的自氧化、脂类物质的过氧化和多元醇通路等途径，它不仅与食品的色香味及营养、安全等方面有关，更与人体健康密切相关[2]。

AGEs可以改善食品色泽和风味，日常食品中存在大量的AGEs物质，是体内AGEs的主要外部来源[1]。含有AGEs 的食品包括咖啡、可乐和巧克力等饮料产品、麦芽制品、浓缩乳和经热加工的乳制品以及肉类制品以及面包等烘焙食品等。膳食中 AGEs 的含量取决于食品中的营养成分(蛋白质、脂肪、碳水化合物等)、加工方式(如煎、炸、烤)和储存条件[3]。

饮食中摄入的AGEs大部分会进入肝脏和其他组织，其中约有1/3随尿液排出[4]。研究表明，内源性AGEs 具有体内积聚性，已被证实AGEs 与糖尿病[5,6]、阿兹海默病[7,8]、动脉粥样硬化[9]、尿毒症[6]和衰老[6]等多种慢性疾病的发病有关，因此 AGEs 成为近年来研究关注的热点，对食品中 AGEs 含量的研究也变得尤为重要。

AGEs具有广泛性、不可逆性、结构异质性、吸收光谱独特等独特的理化特性。目前，用来检测AGEs的方法主要有荧光光谱法、紫外分光光度法、液气相色谱质谱法[10]。 Rada-Mendoza 等[11]研究了18 种以水果为基料的婴儿食品，发现所有样品中都含糠醛，平均含量为1.35 mg/100 g。Chia[13]利用高效液相色谱的方法测定棕榈油中的糠醛含量，得出棕榈油中的糠醛含量在(7.54～20.6) mg/kg，同时证明糠醛的形成与棕榈油的生产工艺存在一定的关系[12]。有学者分析了玉米、小麦等不同主料的冲调谷物中游离和总荧光性AGEs含量，其平均含量分别为(163±157) AU/mg和(1 258±622) AU/mg。Zielinski[14]通过测定荧光性AGEs、糠氨酸、褐变指数，表征了不同种类蛋糕的美拉德反应的进程。

研究表明，由于AGEs形成机制广泛，是多种分子差异、异质物质的总称，AGEs 的检测尚缺乏灵敏、高效的方法。本研究针对谷物食品中不同来源的糖基化产物，以期从色度、吸光度、荧光值以及终产物的含量测定建立简便、综合的评价体系。

1 材料与仪器

1.1 材料

某品牌粗粮消化饼干(酥性饼干，其配料为：小麦粉、鸡蛋、起酥油、麸皮等)；某品牌天然酵母面包(配料：小麦粉、饮用水、白砂糖、食用油脂制品、鸡蛋、乳粉、酵母等)；某品牌燕麦谷物早餐(配料：谷物粉、白砂糖、棕榈油等)。

1.2 试剂

NaH2PO4、Na2HPO4、硝基四氮唑蓝( NBT) 、盐酸羟胺、乙酸钠、冰乙酸、正己烷均为分析纯，甲醇、甲酸、乙腈均为色谱纯。乙二醛、5-羟甲基糠醛(98% HPLC)、糠醛(98% HPLC)、链霉蛋白酶E(4 000 000 PU/g)。

1.3 仪器

DSHZ-300多用途水浴恒温振荡器；UV-1800紫外-可见分光光度计；Agilent1100高效液相色谱仪；荧光分光光度计-970CRT；TDL-5-A型台式离心机；DC-P3全自动色差计。

2 实验方法

2.1 原料预处理

脱脂：将面包、饼干以及谷物早餐室温通风干燥后，粉碎机粉碎。脱脂方法参照文献略作修改[15]。称取10 g样品，加入 50 mL 正己烷，剧烈震荡后在 10 000 g/min下离心 15 min，弃去上清液，重复此步骤三次以彻底脱脂。将脱脂后的粉末样品置于通风橱中，自然挥干残留的正己烷。

结合态糖基化产物的分离：根据是否与蛋白质或多肽结合，AGEs 可分为游离态和结合态，两种形态的 AGEs检测略有差异。结合态 AGEs 的检测程序相对复杂，去除脂肪成分后，通常选取盐酸水解法或酶解法进一步水解蛋白质。文献报道，盐酸水解法易引起其他反应的发生，产生杂质，影响后续实验中 AGEs 的测定[16]。故采用酶解法释放、分离结合态糖基化产物。根据Roncero-Ramos方法稍作修改[17]，将挥发除尽正己烷的样品1 g，溶于30 mL链霉蛋白酶E的溶液中进行酶解，酶解完成后，将酶解液离心，收集上清液过0.45 μm微孔滤膜，待测。为了考察不同酶解条件对结合态糖基化产物的分离的效果，探究了不同酶液浓度(10、20、40、80、160、320、640 μg/mL)、酶解时间(6、12、18、24、36、48 h)对酶解后样品糖基化产物含量的影响。

2.2 褐变程度的评价——色度测定

色度测定用L*值表示亮度，范围在0～100之间，L*值越高表明样品表面越白。a*>0表示红值、a*<0表示绿值，b*>0表示黄值、b*<0表示蓝值。为了能够深入的研究样品的美拉德反应的程度，Delgado-Andrade等[18]报道了利用褐色指数(YI)来表示褐变的程度，其公式为：YI=142.86b*/L*

2.3 糖基化反应进程的评价

吸光度的测定：在美拉德反应的初级阶段，还原糖的羰基和游离氨基发生反应，生成的物质在可见光范围内无吸收，因此，将反应初期生成的小分子物质在280 nm下监测其吸光值[19]。随着美拉德反应的进行，反应中期阶段产生的产物可以在360 nm下监测其吸光值，而在反应的末期，由于聚合反应生成大分子物质(类黑精)，其在可见光420 nm下可以监测到[20]。因此，美拉德反应的进程可以分别通过测定于280、360、420 nm下的吸光值来分析。

荧光性AGEs 的测定：利用AGEs 具有荧光性的特性，根据文献所述糖基化反应终产物的测定方法[13]，通过荧光光度计进行测定。样品用PBS 稀释一定倍数后直接进行荧光值测定，激发波长350 nm，发射波长440 nm，荧光强度以AU/mg 表示。

戊糖素的测定：戊糖素是Amadori 重排产物经过脱氢、重排、交联等一系列反应，最终生成一种具有荧光性的糖基化终末产物之一。戊糖素具有荧光特性，取各组反应样液0.2 mL于试管中，用PBS 缓冲液( 0.2 mol /L，pH 8.0) 稀释至无色后，在在激发波长335 nm、发射波长382 nm处测定其荧光强度，以荧光强度AU/mg 表示[21]。

2.4 中期、末期糖基化反应产物的测定

乙二醛(GO) 的测定：GO 为非酶糖基化反应的初中期产物，是一种简单的二羰基化合物，利用醛基成肟反应生成的乙二醛二肟的生成量变化反映出GO 的含量变化[21]。测定方法为取各组反应样液0.5 mL 于50 mL 容量瓶中，加入乙酸钠溶液(15 g/L)1 mL、盐酸羟胺溶液(2 g/L)2 mL，于50 ℃恒温水浴中加热20 min，冷却后定容，在233 nm 处测其紫外吸光值。

5-羟甲基糠醛(5-HMF)和糠醛(HMF)测定：5-HMF和HMF是美拉德反应产物。5-HMF 是美拉德反应中期Amadori 重排产物经烯醇化后脱水形成的醛类化合物，为中期产物生成的另一种途径。采用液相色谱仪测定5-羟甲基糠醛和糠醛的含量。分别用蒸馏水配制一系列质量浓度(10、20、40、50、60 μg/mL)的5-HMF和HMF的标准液，经过0.45 μm的水系微孔滤膜过滤后进样，绘制5-HMF和HMF的标准曲线。

色谱条件：反向色谱柱Agilent Zorbax XDB-C18(150 mm×4.6 mm i.d., 5 μm)；测定5-HMF流动相为甲醇 ∶水=90 ∶10，流速0.6 mL/min；测定HMF流动相为乙腈 ∶水(0.1%甲酸)=2 ∶98，流速 1 mL/min。 进样量20 μL，检测波长280 nm，柱温35 ℃。

2.5 数据分析

所有实验均进行3次重复，数据以平均值±标准差表达。利用SPSS 数据处理软件进行分析，P<0.05差异显著。

3 结果与分析

3.1 酶解参数对谷物食品结合态AGEs分离效果的影响

3.1.1 酶浓度对结合态AGEs分离效果的影响

根据是否与蛋白质或多肽结合，AGEs 还可分为游离态和结合态，两种形态的 AGEs检测略有差异。对样品去除脂肪成分后，通过蛋白酶进行水解，将结合态 AGEs 进行释放进行检测。

图1 不同酶浓度对谷物食品荧光性AGEs 含量的影响

由图1可知，随着酶浓度的增加，谷物食品(谷物早餐、饼干和面包)中荧光性AGEs 含量随之增加。其中，当酶浓度为320 μg/mL，谷物早餐中荧光性AGEs 含量最大，为1 810 AU/mg；当酶浓度为640 μg/mL后，继续增加酶浓度，饼干和面包中的荧光性AGEs 含量增加缓慢(P>0.05)，因此，谷物早餐的酶解浓度为320 μg/mL，饼干和面包的酶解浓度均为640 μg/mL。AGEs 是多种分子结构不同物质的总称。具有交联及产生荧光的特性。但羧甲基赖氨酸、羧乙基赖氨酸和吡咯素等AGEs 无荧光性，因此荧光性只能反映部分AGEs 的含量[22]。因此，需要对糖基化反应产物进行全面的表征，应采取不同的测定方法。

由表1可知，不同酶浓度处理的谷物食品，L*值均在10～30之间，随着酶浓度的升高，L*降低，即谷物食品的亮度值更接近黑色方向，表明谷物食品发生了明显的褐变反应。而a*值、b*值和YI值随之增加，表明糖基化产物的增加，可见，当酶浓度为320～640 μg/mL时，结合态的AGEs释放较为充分。

表1 不同酶浓度对谷物食品色度的影响

3.1.2 酶解时间对结合态AGEs分离效果的影响

图2 不同酶解时间对谷物食品荧光性AGEs 含量的影响

由图2可知，随着酶解时间的增加，谷物食品(谷物早餐、饼干和面包)中荧光性AGEs 含量随之增加，当酶解时间达到36 h，谷物早餐、饼干和面包中荧光性AGEs含量趋于稳定，分别为1 600、1 860和1 726 AU/mg，由此可见，谷物食品的酶解时间为36 h，酶解较为充分。

由表2可知，随着酶解时间的增加，L*降低，而a*值、b*值和YI值随之增加，表明通过酶解反应的进行，结合态AGEs释放的愈加充分，从而反映出谷物食品褐变程度加剧。可见，最佳的酶解时间为36 h。

表2 不同酶解时间对谷物食品色度的影响

3.2 谷物食品糖基化产物的含量测定

3.2.1 美拉德反应产物的测定

5-HMF是由还原糖在酸性环境下，经过Amadori反映后形成的环状化合物。HMF是糖的降解产物或者Amadori反应的产物。利用HPLC建立了5-HMF、HMF的测定方法。其样品测定谱图如图3所示。该测定方法，5-HMF和HMF标准溶液均在10～60.0 μg/mL质量浓度范围内呈良好线性，相关系数(r)均大于0.99。添加水平为50、100 μg/kg时，平均回收率为90.6%～93.3%。

3.2.2 糖基化反应产物的测定

由表3可知，早餐谷物、面包和饼干色度依次增加，表明饼干的褐变程度强于面包和谷物早餐。李晓琳[23]通过实验发现，与面包芯相比，面包皮更偏向黑色、红色、黄色方向，这表明面包皮褐变程度最高，面包皮的美拉德反应程度高于面包芯。面包面团在焙烤的过程中，表面温度高达 230～250 ℃，导致面团表面水分蒸发，面包表面发生美拉德反应，生成 AGEs[23]。饼干的褐变程度高于面包，主要是由于其加工工艺以及添加物有关，有报道指出，饼干、面包、谷物早餐中添加的其他成分(水果、NaCl或膳食纤维)，其添加种类和数量的差异显著影响其美拉德反应的程度[24-26]。据文献报道，测定280、360、420 nm处的吸光值分别表示美拉德反应早期，中期和末期产物的含量[18]。由表3可知，早餐谷物中美拉德反应初期产物积累较多,其含量显著高于饼干和面包中含量(P<0.05)，而面包和饼干其积累的美拉德中期和末期反应产物显著高于早餐谷物中(P<0.05)，此结果与荧光性AGEs和戊糖素的积累量相似。

图3 5-HMF和HMF含量测定的HPLC图

表3 谷物食品糖基化反应进程及其产物含量

由表4可看出，糖基化反应初中期产物(丙二醛、5-HMF)主要反映在早餐谷物和面包中。而中后期产物5-HMF、HMF主要积累在面包和饼干，其含量显著高于早餐谷物(P<0.05)，食品的颜色变化主要发生在美拉德反应的后期，蛋白质和糖类反应生成的黄色或棕色与美拉德反应的中间或末期产物有关[27]。这是因为糠醛很活泼，容易与其他物质发生反应。在美拉德反应的末期阶段，会发生一系列反应包括：环化、脱水、重排，异构化和聚合，最终形成含氮的棕色聚合物或共聚物，类黑精[28]，此现象也反映在420 nm吸光值以及色度(表3)。

表4 谷物食品中、末期糖基化产物含量

4 结论

本研究优化了不同酶浓度和酶解时间对谷物早餐、饼干和面包的前处理方法，通过色度和吸光度的测定，表征谷物食品褐变程度，以此反映美拉德反应产物的含量，通过荧光强度的测定，表征了荧光性AGEs产物的含量，通过建立5-HMF和HMF的测定方法，表征了糖基化不同反应时期的产物的含量。通过以上定性和定量方法的建立，焙烤类谷物食品中荧光性晚期糖基化终产物(AGEs)含量依次为：饼干(1 890 AU/mg)、面包(1 886 AU/mg)、谷物早餐(1 678 AU/mg)。饼干中戊糖素、5-HMF和HMF含量分别为1 450 AU/mg、300.1 μg/g和300.01 μg/g，面包中戊糖素、5-HMF和HMF含量分别为：1 278 AU/mg、430 μg/g和290.13 μg/g，而早餐谷物中初期(A208)、中期糖基化产物(A360)吸光值显著高于饼干和面包(P<0.05)，因此，初期糖基化反应产物在早餐谷物中含量丰富，中期和末期糖基化反应产物在面包和饼干中含量丰富。 本研究建立了系统测定糖基化产物的检测体系，该体系可以简便、全面、综合的表征不同反应途径和反应程度的糖基化产物的含量。