桃红四物汤对UV辐射致人真皮微血管内皮损伤后TGF-β、Smad2/3表达影响的实验研究❋

张小卿，马贤德，吴 怡，王建军，吴景东△

(1. 辽宁中医药大学，辽宁省针灸养生康复重点实验室，沈阳 110847； 2. 辽宁中医药大学附属二院， 沈阳 1100342； 3. 西安海棠职业学院，西安 710038)

日光中的长波紫外线(UVA)辐射可深入皮肤真皮以下的组织，破坏皮肤胶原蛋白，弹性纤维组织等微细结构产生皱纹，令皮肤松弛衰老，这在医学上称之为皮肤光老化[1]。中医学认为皮肤光老化主要由光毒侵袭所致，且其伤害无法逆转[2]。光毒侵袭日久，导致体内正气虚损，日久气血渐衰，运行缓滞，血脉瘀阻，以致血瘀。桃红四物汤在临床治疗由血瘀引起的多种病证都有显著效果，在皮肤科常用以治疗黄褐斑、过敏性紫癜等疾病。基于前期对UV辐射致人真皮微血管内皮细胞(HDMEC)损害的研究发现，转化生长因子(Transforming growth factor， TGF-β)活性表达的增加，具有促进Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白含量的作用，细胞中释放的TGF-β受体激活Smad蛋白后，形成的TGF-β/Smads信号传导通路可以通过调控其下游的基因表达来控制胶原合成，因此本实验观察了桃红四物汤对UVA辐射致HDMEC细胞损伤后TGF-β、Smad2/3的含量表达，进而探讨其对皮肤光老化的防治作用。

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF级8周龄SD雄性大鼠20只，体质量(200±20) g，购自辽宁本溪长生生物技术有限公司(许可证号SCXK(辽)2010-0001)。

1.2 桃红四物汤方药组成

熟地15 g，当归15 g， 白芍10 g， 川芎8 g， 桃仁9 g，红花6 g。

1.3 实验细胞

人真皮中微血管内皮细胞(HDMEC)购自通派(上海)科技有限公司。

1.4 实验试剂

Anti-TGF-β: ab92486，兔多克隆抗TGF -β抗体，适用于人、小鼠、大鼠等来源样本，ABCAM公司；Anti-Smad2: ab33875，兔单克隆抗Smad2 抗体，适用于人、小鼠、大鼠等来源样本，ABCAM公司；Anti-Smad3: ab40854，兔单克隆抗Smad3抗体，适用于人、小鼠、大鼠等来源样本，ABCAM公司；Anti-β-actin：ab8226，小鼠单克隆抗β-Actin抗体，适用于人、小鼠、大鼠等来源样本，ABCAM公司。TUNEL试剂盒，江苏凯基生物技术股份有限公司，KGA7071。

1.5 实验仪器

UV辐照计(UV-340)，上海Sigma高科技有限公司；全自动酶标仪(anthos 2010型)，奥地利anthos公司；倒置荧光生物显微镜，德国莱卡公司；多孔离心机(c412)，法国Jouan公司；细胞培养瓶(25 cm2)，美国康宁公司；培养板(6孔、96孔)，美国康宁公司；凝胶成像分析系统(Chemi Imager 5500型)，美国Alphainnotech Chemi Imager 公司；垂直版电泳装置(Mini-Protein Ⅲ型)，美国BIORAD公司。

2 方法

2.1 含药血清的提取

将25只SD大鼠随机分成5组，空白血清组给予生理盐水2 ml/只，阳性对照组给予维生素E0.09 mg/只，其余3组分别给予高剂量桃红四物汤、中剂量桃红四物汤、低剂量桃红四物汤。桃红四物汤给药量根据《等效剂量系数折算法》计算200 g大鼠每天为1.23 g，低、中、高剂量含药血清组采用3、6、9倍等效剂量作为实验用量，将药物浓缩至2 ml，灌胃7 d后提取大鼠血清。

2.2 紫外线照射

取对数生长期的HDMEC细胞，照射前弃去旧培养液，0.25%胰酶消化后，加入新鲜培养液制成细胞悬液接种于96孔板，于37 ℃ 5%CO2培养箱培养24 h后弃去旧的培养液，PBS清洗2次，反复洗至PBS无色加入200 μL PBS，放在紫外线下照射。照射前用UV辐照计测试UVA紫外灯强度，照射距离固定，UV剂量=UV辐照强度×时间，对照孔给予锡箔纸覆盖，照射后吸去孔内PBS，加入新鲜培养液放回培养箱内继续培养。

2.3 MTT 法检测不同剂量UVA对HDMCE细胞增殖活性的影响

不同剂量UVA(2、5、8、10 J/cm2)照射HDMCE细胞后培养24 h，加入20 μL 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT， 5 g/L)，37 ℃培养箱继续孵育4 h后终止培养，每孔加入150 μL 二甲基亚砜(DMSO)低速振荡致均匀混合，酶标仪选择OD 490 nm处测量各孔A值。

2.4 细胞分组及干预

将HDMEC细胞株分为空白对照组、模型对照组、桃红四物汤高剂量组、桃红四物汤中剂量组、桃红四物汤低剂量组和阳性对照组6组。除空白对照组外，其余各组细胞株均给予5 J/cm2的UVA照射，之后模型对照组加入空白血清培养液，其他各组加入相应含药血清培养液，培养24 h收集细胞及50 ml培养上清液，用于检测上清液中TGF-β含量。瓶底部的细胞用PBS缓冲液洗涤3次，末次弃掉PBS后，加入1 ml WB及IP细胞裂解液，轻摇培养瓶使裂解液铺满瓶底，冰面上裂解15 min，然后以移液器吹打裂解液，使细胞全部裂解，冰面上静置5 min后，12000 g离心力，4 ℃离心15 min，上清液即为总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，采用凝胶成像分析系统自带软件测定目的蛋白和内参蛋白条带的灰度值，并以目的蛋白条带灰度值/内参条带灰度值的比值，作为该蛋白的相对表达水平进行统计分析。

2.5 采用Tunel法对各组细胞凋亡进行检测

图1 不同强度UVA照射细胞活性OD值折线图

制备细胞爬片，并以2%多聚甲醛溶液固定24 h，然后在流水下充分冲洗，吸干爬片周边水分后滴加蛋白酶K，37 ℃孵育30 min透膜，然后PBS洗涤3次。滴加TDT酶反应液50 μl/片，37 ℃避光孵育60 min。取出爬片后PBS漂洗3次，滴加Streptavidin-Fluorescein 标记液，湿盒中37 ℃孵育30 min，取出后洗涤3次，荧光显微镜下观察细胞凋亡情况。每张细胞爬片选取5个染色良好视野，计数每个视野中凋亡的细胞数，以5个视野的平均凋亡数作为该例样本的细胞凋亡水平并进行统计分析。

3 结果

3.1 UVA照射后HDMEC增殖活性变化显示

随着UVA照射时间的加长即照射剂量的不断加大，各照射组细胞活性明显减弱(P<0.05)，UVA照射剂量为5 J/cm2时，OD值切线与X轴的夹角呈最大，说明在此照射剂量时HDMEC活性被明显抑制。因此本研究选择UVA剂量为5 J/cm2，作为HDMEC损伤模型的UVA照射剂量。

3.2 细胞凋亡情况

表1图2显示，与空白对照组比较，模型对照组细胞凋亡数显著上升，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型对照组比较，桃红四物汤含药血清干预的各组细胞凋亡数均显著下调，差异有统计学意义(P<0.01)，且高剂量含药血清组干预效果最为显著。

注：图中浅色箭头所示为发生凋亡的细胞图2 各组细胞凋亡情况比较

表1 各组细胞凋亡率及细胞培养上清液中TGF-β含量比较

注：与空白对照组比较：*P<0.05，**P<0.01；与模型组对照比较：##P<0.01；与桃红四物汤高剂量组比较：▲▲P<0.01

3.3 细胞培养上清液中TGF-β含量

表1显示，与空白对照组比较，其余5组细胞TGF-β含量显著降低，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；与模型对照组比较，高中低剂量桃红四物汤组及阳性对照组细胞培养上清液中TGF-β含量显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)，尤以高剂量和阳性对照组上升最为明显。

3.4 各组细胞中TGF-β、Smad2/3表达结果

表2图3显示，UVA辐射后各组TGF-β、Smad2/3表达降低(P<0.01)；与模型对照组比较，桃红四物汤高、中剂量组及阳性对照组细胞中TGF-β表达显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与高剂量组比较，低剂量组TGF-β表达上升不明显，中、低剂量组Smad2/3表达上升不明显，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。

表2 各组细胞中TGF-β、Smad2/3蛋白表达水平比较

注：与空白对照组比较：**P<0.01；与模型对照组比较：##P<0.01；与桃红四物汤高剂量组比较：▲P<0.05，▲▲P<0.01

图3 各组细胞中TGF-β、Smad2/3蛋白条带比较

4 讨论

日光中的紫外线过量照射皮肤，侵袭肌肤腠理，属于外邪致病范畴，中医称为“光毒”，感受光毒侵袭是引起皮肤光老化的重要病因之一。“光”性炎热属阳，为热毒之一。《洞天奥旨》记载：“日晒疮，乃夏天曝烈之日曝而成者也，必先疼而后破，乃外热所伤，非内热所损也。[3]”当光毒热邪侵入人体后，火热蕴结灼伤津液，耗气伤血，日久则气血亏虚，血液运行迟滞。所以，气血运行不畅致使气血阻滞，血脉瘀阻，易出现色素沉着、斑块瘀积、皮肤日久失去气血濡养，则加快皮肤衰老的进程[4]。由此可见，血瘀内结是皮肤光老化的主要发生机制，我们可以从活血化瘀角度防治皮肤光老化的发生与发展。

UV辐射引起皮肤光老化的损伤机制包括氧化应激、DNA损伤、炎症反应、免疫抑制、晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)、分解细胞间基质、减少细胞间基质合成、破坏皮肤组织间结构、提高细胞突变频率、延缓细胞周期、诱发细胞凋亡等[5-7]方面。真皮微血管内皮细胞是真皮的主要细胞，组织定位决定了真皮微血管内皮细胞在皮肤各种生理及生化反应中发挥着关键作用[7]，能够活化参与多种生理过程，通过增殖、休眠、凋亡和老化这4个基本细胞状态建立皮肤微血管维持和重塑之间的动态平衡。长期照射可以引起真皮微血管内皮细胞结构和功能的改变，血管通透性明显增高，导致氧化损伤的发生及炎症因子的聚集，从而影响真皮的结构和功能，导致皮肤损伤及光老化的发生。桃红四物汤中含有的多种有效成分，李双双等[8]测定桃红四物汤中含有苦杏仁苷、羟基红花黄色素A、梓醇、地黄苷A、阿魏酸、芍药苷、原儿茶酸、绿原酸、没食子酸9种水溶性活性成分。上述成分可以清除血液内的自由基，提高抗氧化酶活性，抑制UV诱导的胶原蛋白降解，改善皮肤微循环，从而减缓皮肤的衰老，增强皮肤的抗衰老能力。

通过前期对UV辐射致人真皮微血管内皮细胞损害的研究发现，TGF-β活性表达的增加具有促进Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白含量的作用，与皮肤光老化发病机制密切相关，具有调节炎症、防止细胞外基质的降解、促进血管生成和胶原合成的作用[9]。Smad蛋白是介导TGF-β信号传导过程中的关键，TGF-β受体被激活后磷酸化产生Smads蛋白，与TGF-β超家族形成TGF-β/Smads信号传导通路共同发挥调控细胞因子的作用与生理功能[10]。紫外线照射可通过影响TGF-β/Smads信号传导通路，使体内胶原蛋白水平表达降低[11]，进而出现皮肤衰老。Gambichler[12]等学者发现，经过UV辐射24 h后的皮肤中TGF-β与Smads蛋白含量表达明显减少，TGF-β信号传导通路在Smad2/3的诱导下影响胶原蛋白的合成，加速了衰老。另外，基质金属蛋白酶(MMPs)在皮肤光老化发生机制中起核心作用。何永静[15]等通过观察UVA 照射下TGF-β1对成纤维细胞中MMP-1、MMP-3 的表达影响证实，TGF-β1可以通过抑制细胞中 MMP-1、MMP-3mRNA 的表达降低，促进对Ⅰ型、Ⅲ型胶原的合成，说明TGF-β1对成纤维细胞起到保护作用以及在皮肤光老化形成机制中具有重要作用。

本研究发现，HDMEC经过UV辐射刺激受到损害后，细胞中TGF-β的表达含量降低，直接导致其分泌的Smad蛋白减少，由Smad介导的TGF-β/Smad信号传导通路信号的调控作用则会随之减弱，用不同剂量的桃红四物汤含药血清干预后，各组细胞中TGF-β、Smad2/3的表达含量都有不同的升高，且剂量越高效果越好，说明桃红四物汤可以促进受损的HDMEC分泌TGF-β、Smad蛋白含量，增强TGF-β/Smad信号传导通路的信号强度，使其能够正常发挥对下游信号分子的调控影响作用，为应用桃红四物汤治疗皮肤光老化的研究提供新的实验依据。