颜氏大疣蛛蛛毒中多肽和蛋白质的多样性分析

王梦如， 张秀清， 王颖， 周思彤， 杨自忠， 李龙星， 杨志斌*

(1. 云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南大理671000； 2. 药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心，云南大理671000； 3. 中国西南药用昆虫及蛛形类资源开发利用协同创新中心，云南大理671000；4.大理大学分析测试中心，云南大理671000)

颜氏大疣蛛Macrotheleyani隶属于蛛形纲Arachinida蜘蛛目Araneae后纺亚目Opisthothelae原蛛下目Mygalomorphae大疣蛛科Macrothelidae，最早由Xu等(2002)发现于云南省高黎贡山并以单性雌蛛报道，Shi等(2018)发现了雄蛛并对雌蛛的部分特征进行了补充描述。本种与单卷大疣蛛M.monocirculata相似，但单卷大疣蛛的两性均具触肢转节桨状毛发声器而颜氏大疣蛛雌雄均无。该种广泛分布于云南的西北部地区，不同地区雄性个体触肢器的长度和形状一致，而雌性个体纳精囊的长度和形状多变(张蕊，2007)。目前除了对颜氏大疣蛛的形态鉴别以外，暂未有其他相关报道。

蛛毒现已逐渐成为生物毒素研究的新热点，其含有大量具有潜在药用价值的新型化合物，在生物和医学研究领域中占有重要地位。但野生蜘蛛驯养难，与其他毒素相比，蛛毒量少且不易采集，很难进行深入的研究(黄新等，2007；Klintetal.，2012；Windleyetal.，2012)。目前本课题组已经实现了对颜氏大疣蛛的人工养殖并在取毒技术上取得了进展，成功实现了对蛛毒的富集(图1)。本试验利用超高效液相色谱-电喷雾-四极杆-飞行时间质谱(UPLC-ESI-Q-TOF-MS)技术和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术分离和鉴定了颜氏大疣蛛粗毒中多肽和蛋白质的组成，首次对其富含的多肽与蛋白质的多样性进行了探索，为后续对该毒素的物质基础研究及药用开发提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 仪器材料

质谱仪(compact QTOF，Bruker)，超高效液相色谱仪(UltiMate 3000，戴安)，电子天平(BSA124S，赛多利斯)，垂直电泳仪(Mini-Protein，Bio-Rad)，低温高速离心机(5430R，Eppendorf)，冷冻干燥机(FD8-4a，GOLD-SIM)。SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(20171120，Solarbio)，SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(101218181015， 碧云天5×)，甘氨酸(418Q066，Solarbio)，Tris(527K073，Solarbio)，SDS(323A033，Sigma)，Marker(20160425，Solarbio 11～180 kDa)，考马斯亮蓝G-250(No.C8430，Solarbio)，乙腈(178497，TEDIA)，三氟乙酸(TFA； 17040277，TEDIA)，其他试剂均为国产分析纯，水为超纯水。

图1 颜氏大疣蛛的养殖(A)与取毒(B)技术Fig. 1 The breeding (A) and venom collection (B)techniques of Macrothele yani

1.2 蛛毒

蛛毒取自颜氏大疣蛛成虫，虫种由大理大学昆虫生物医药研究院杨自忠教授采自模式产地，现存于大理大学昆虫生物医药研究院。供试个体的养殖与取毒均由大理大学昆虫生物医药研究院养殖基地完成。用透明、通风良好的塑料盒进行饲养，内部搭建人工庇护所。饲养条件：温度26 ℃±1 ℃，相对湿度60%±5%，避光。

1.3 粗毒收集

将一次性离心管作为毒液接收器，从侧面夹住蜘蛛胸部将其固定，用手固定蜘蛛的步足，让蜘蛛张开鳌牙并咬住离心管内壁，用自制脉冲电流取毒器(电压6 V)的正、负两极分别接触蜘蛛的左右鳌肢，间断刺激3～5 s。用少量超纯水冲洗螯牙和内壁上的毒液至离心管内，每两周采集一次。收集足量的毒液后经真空冷冻干燥得白色或略带黄色的粉末，即为粗毒粉末，-20 ℃保存。

1.4 供试品溶液的制备

取一定量的粗毒粉末用超纯水溶解至浓度为30 mg·mL-1，4 ℃ 10 000 r·min-1离心10 min，0.22 μm滤膜滤过得到供试品溶液。

1.5 SDS-PAGE检测

采用SDS-PAGE测定供试品溶液的蛋白质相对分子质量，使用5%浓缩胶和12%分离胶，具体操作参考SDS-PAGE凝胶制备试剂盒说明书。电泳完成后用考马斯亮蓝G-250染色。蛋白质相对分子质量的计算方法如下：以标准蛋白质相对分子质量(Mw)的对数(lgMw)为纵坐标，标准蛋白质的相对迁移率(Rf)为横坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程及回归系数。将样品的Rf值代入回归方程计算出lgMw，从而得到样品的相对分子质量。Rf=L1/L2，其中，L1为加样孔至条带中心的距离，L2为加样孔至溴酚蓝区带的距离。

1.6 UPLC-ESI-Q-TOF-MS检测

色谱条件：使用超高效液相色谱仪，色谱柱为Agilent Poroshell 120 EC-C18(3.0 mm×150 mm，2.7 μm)，流动相为0.1%TFA水溶液(A)-0.1%TFA乙腈(B)，梯度洗脱(0～13.92 min，5%→21%B；13.92～21.57 min，21%B；21.57～83.25 min，21%→95%B)，流速0.2 mL·min-1，进样量10 μL，检测波长为214 nm，柱温30 ℃。

质谱条件：使用高分辨质谱仪，离子源采用电喷雾离子源，正负离子检测模式，毛细管电压3 500 V，扫描范围300～3 000 m/z，雾化器气体压力2.0 Bar，干燥气体流速8.0 L·min-1，干燥加热温度200 ℃。

1.7 数据分析

质谱数据的分析采用Bruker的Data Analysis 4.0，数据的整合及作图采用GraphPad Prism 5.01和Origin 2018。

2 结果与分析

2.1 粗毒的SDS-PAGE分析

利用SDS-PAGE对颜氏大疣蛛粗毒中蛋白质的相对分子质量分布进行了测定。结果表明，样品的SDS-PAGE最佳上样量为15 μL。电泳图谱中，除相对分子质量在11 kDa以下的多肽外，其他蛋白质主要分布在35 kDa以上的区域。其中，在17～135 kDa的区域内，分离度较佳的条带共有11条，75 kDa附近区域弥散着高丰度的蛋白质条带，75 kDa 以上的区域蛋白质最为丰富，分布过密，未能实现良好分离(图2)。

图2 颜氏大疣蛛粗毒的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳Fig. 2 The sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis results of the crude venom of Macrothele yani

a. 标准蛋白质， b～e. 上样量分别为5 μL、10 μL、15 μL和20 μL

a. Marker， b-e. the amount of loading is 5 μL， 10 μL， 15 μL and20 μL， respectively

根据标准蛋白质条带绘制成标准曲线(图3)，回归方程lgMw=-1.332 8Rf+2.392 5，r为0.992 3。将样品中11条电泳条带的Rf值代入公式计算，Mw依次为20 kDa、24 kDa、40 kDa、45 kDa、52 kDa、63 kDa、74 kDa、82 kDa、90 kDa、110 kDa和 122 kDa。由此可见，颜氏大疣蛛粗毒中中等分子量蛋白质相对集中于40～120 kDa区域。

2.2 粗毒的UPLC-ESI-Q-TOF-MS分析

颜氏大疣蛛粗毒的反相超高效液相色谱图和质谱总离子流图见图4。结果显示，粗毒的成分复杂，在214 nm波长下可以检测到超过50个色谱峰，其中保留时间为16.5 min的色谱峰吸收最强，其他大部分色谱峰于30～60 min内被洗脱，属于中等极性类的物质成分，少部分色谱峰于10 min内即被洗脱，属于极性类的物质成分(图4：A)。经ESI-Q-TOF-MS鉴定(图4：B、C)，15 min内的质谱峰较少，该时间段的洗脱峰主要是小分子化合物和盐类，大部分质谱峰(30～60 min)为多肽类物质，属于粗毒中含量比较丰富的一类物质。经对质谱正负离子模式下的离子峰进行信号归属，去除冗余，大多数质谱峰中均出现了2个以上的信号且多为多电荷离子。这说明很多疏水性相近、相对分子质量有差异的多肽分子存在于同一洗脱峰中。本试验共分离和鉴定得到8个单一成分(表1)。

图3 SDS-PAGE标准蛋白质相对分子质量标准曲线Fig. 3 The standard curve of molecular mass ofSDS-PAGE protein marker

2.3 粗毒的分子多样性分析

从粗毒中分离和鉴定了121个物质成分，展示了粗毒的分子多样性(图5：A)。粗毒中多肽的相对分子质量呈典型的双峰式分布，21%的多肽分子分布在500～2 000 Da附近区域，76%的多肽分子分布在3 000～5 000 Da区域内(图5：B)，此区域的多肽分子是粗毒中含量最为丰富的部分，后续可作为颜氏大疣蛛粗毒结构与功能研究的主要部分。通过对实验数据的梳理，以流分、质荷比(m/z)和质谱峰强度分别为X轴、Y轴和Z轴绘制颜氏大疣蛛粗毒中分子的三维分布图(图5：C)，展示了粗毒中所含成分的保留时间、相对分子质量以及质谱峰强度，特别是针对那些因疏水性相近而分离度不佳且有差异的多肽。主要的多肽分子群于35～60 min的保留时间内被洗脱，Mw为3 000～5 000 Da，其中，45～60 min的时间段内最多。

图4 颜氏大疣蛛粗毒的超高效液相色谱图和质谱总离子流图(+/-)Fig. 4 The UPLC chromatogram andtotal ion chromatograms (+/-) of mass spectrometry in the crude venom of Macrothele yani

a.色谱模式， B. 正离子模式， C. 负离子模式

a.the chromatographic mode， B. the positive ion mode， C. the negative ion mode

表1 颜氏大疣蛛粗毒中单一成分的相对分子质量Table 1 Molecular mass of single component of the crude venom of Macrothele yani

3 讨论

3.1 与其他蛛毒的多样性比较

本文采用SDS-PAGE和LC-MS技术首次对颜氏大疣蛛粗毒的蛋白质和多肽成分进行了分子多样性的初步探索，共分离和鉴定了121个物质成分，其中，21%和76%的多肽物质Mw分别分布在500～2 000 Da和3 000～5 000 Da的区域，呈双峰式分布。粗毒中所含蛋白质的Mw主要集中在40～120 kDa。该结果与已报道的漏斗网蛛Hadronycheversuta粗毒、敬钊缨毛蛛Chilobrachysjingzhao粗毒和虎纹捕鸟蛛Selenocosmiahuwena粗毒的多肽分子量分布研究结果类似。漏斗网蛛粗毒中多肽的Mw呈双峰分布于3 000～5 000 Da和6 500～8 500 Da 2个区域(Escoubasetal.，2006)；敬钊缨毛蛛粗毒中70%的多肽Mw在3 000～5 000 Da，10%则分布于5 000～8 000 Da(Liaoetal.，2010)；虎纹捕鸟蛛粗毒中77.4%的多肽Mw在3 000～5 000 Da(Yuanetal.，2007)。这表明无论是颜氏大疣蛛蛛毒还是其他不同科的蛛毒，在物种进化过程中存在一定的同源性，但具体差异或又体现了它们之间不同进化方式的选择。因此，进一步研究颜氏大疣蛛与其他蛛毒的蛋白和多肽分子差异性，将有助于了解蛛毒的进化机制及其生物活性机制。

3.2 多样性分析方法的局限性

大多数动物类毒素均含有较为丰富的多肽和蛋白质类活性物质，利用电泳和液质联用技术相结合，对蛋白和多肽类物质成分进行分离和鉴定是目前常用的技术手段，具有专属性好、灵敏度高和分析速度快等优势，目前已有利用相关技术对蛛毒等各类动物毒素研究的报道(Escoubas & Rash，2004；Escoubasetal.，2008；Duanetal.，2013)，但该技术也存在一定的局限性。想要对蛛毒中的多肽及蛋白类物质的多样性及其丰度有较为全面的了解，相对较困难，主要原因如下：(1)蛛毒的成分较为复杂，除了蛋白和多肽类物质外，还有丰富的无机盐和多胺类、氨基酸类及核苷酸类等小分子物质(Ikonomopoulou & King，2013)，这些成分在质谱中大多数易离子化，从而干扰多肽分子的离子化过程，造成检测灵敏度低甚至无法检出；(2)蛛毒中存在大量疏水性相似但分子量不同的多肽分子，利用反相液相色谱很难将其分离，从而导致在质谱鉴定时难以区分。与MALDI-TOF质谱易形成单电荷离子峰的特性相比，Q-TOF质谱在分析生物大分子时通常会产生多电荷离子峰，更增加了解析的难度；(3)蛛毒中的多肽非常丰富，除丰度较大的多肽分子外，还有很多含量很低、现有质谱技术很难鉴定和区分的物质(Escoubasetal.， 2006)。综上所述，这些影响因素可能也导致了本试验中经分离和鉴定得到的多肽分子数目偏少，对颜氏大疣蛛粗毒的蛋白质和多肽分子多样性的分析存在一定的局限性。在后续研究中，可通过建立颜氏大疣蛛毒腺的cDNA文库对其毒素的分子多样性进行进一步的探讨和补充。

图5 颜氏大疣蛛粗毒的分子多样性
Fig. 5 Molecular diversity of the crude venom inMacrotheleyani

a.结合超高效液相色谱和质谱数据的颜氏大疣蛛粗毒分子质量分布； B. 直方图显示了粗毒中分子质量的分布频率， 曲线显示了粗毒中液质鉴定成分的累计总数； C. 颜氏大疣蛛粗毒中分子的三维分布图

a. Molecular mass distribution of the crude venom inMacrotheleyaniby RP-UPLC and ESI-Q-TOF-MS analysis； B. The histogram shows the frequency of molecular mass in the crude venom， the overlaid curve shows the cumulative total of component masses identified from UPLC-ESI-Q-TOF-MS analyses； C. 3D distribution of the crude venom inMacrotheleyani