共培养微藻Monoraphidium sp. eh1和Monoraphidium sp. eh3提高油脂产率和沉降率

肖钧木，赵飞燕，崔 娜，丁 巍，余旭亚，徐军伟，赵 鹏

(昆明理工大学 生命科学与技术学院，昆明 650500)

由于传统化石燃料的日渐衰竭和环境问题的日益紧张，对可再生环境友好型能源的探索需求也越来越迫切[1]。以微藻油脂为原料的第三代生物柴油是一种对环境无污染且可再生的新型生物能源，在技术上已经可以进行生产，但由于成本较高，尚未实现大规模工业化。微藻产油的关键在于提高油脂产率和降低采收成本，较低的油脂产率是微藻产油相对于传统化石燃料的劣势[2]，目前还未能得到很好的解决；而较高的采收成本制约着微藻生物柴油的工业化生产。据相关研究[3]表明，微藻生物柴油的采收成本占总生产成本的20%～30%。因此，提高油脂产率和降低采收成本，是实现大规模工业化微藻产油的当务之急。

现有提高油脂产率的方法包括基因敲除[4]、添加诱导剂[5]、非生物胁迫、添加金属离子[6]、发酵罐培养和跑道池培养等。采收方法有离心法、沉降法、过滤法和絮凝剂法等[7]。但是在微藻合成油脂和微藻采收方面，这些方法存在着能耗高、效率低、需增加额外的设备、前期投入较大、成本高等缺陷。

有研究[8]表明，共培养能使培养体系内的两种微藻间产生竞争关系，促进油脂的合成，进而提高油脂含量和油脂产率，并且具有能耗低、效率高、成本低和污染小等优点。微藻细胞较小，细胞表面带负电荷，细胞间相互排斥，难以聚集形成絮凝沉淀，自然沉降收集微藻细胞较为困难[9]。通过调节培养后体系的pH，能够降低微藻细胞表面电势，有效促进细胞间的聚集，加速细胞的沉降，便于微藻细胞的采收[3,10]。本文对两株单针藻Monoraphidiumsp. eh1和Monoraphidiumsp. eh3进行共培养，对油脂产率及絮凝效率进行研究，以期找寻一种同时兼顾提高油脂产率及促进细胞絮凝沉降的方法，为微藻生物柴油的大规模工业化生产提供可行的应用思路和一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

单针藻Monoraphidiumsp. eh1(简称eh1)和Monoraphidiumsp. eh3(简称eh3)，均从云南省高原淡水湖洱海(N25°36′～25°58′，E100°06′～100°18′)水样中分离得到，纯化培养后经18S rRNA比对并结合形态学分析鉴定为单针藻。BG-11培养基，调整pH至7.0后121℃高压灭菌20 min备用。

TS-1102恒温(恒湿)振荡摇床，JS94H Zeta电位分析仪，5810R高速冷冻离心机(德国)，Agilent 7890气相色谱仪，Specord Plus分光光度仪，VITLAB英霍夫沉降管(德国)，LDZX-50KBS灭菌锅，FA2004N分析天平，HHW-D6水浴锅，磁力搅拌器。实验所用试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 微藻培养

在含有300 mL培养基的500 mL锥形瓶中，接种单针藻eh1与单针藻eh3，初始细胞浓度均为2.00×106个/mL，在恒温摇床进行共培养，控制培养条件为培养温度25℃、转速150 r/min、光照强度3 500 lx。另外，分别接种eh1、eh3进行单独培养，初始细胞浓度均为4.00×106个/mL。

1.2.2 生物量和比生长速率测定

取培养至稳定期的藻液，于13 000g离心5 min，去上清，去离子水反复洗涤沉淀3次得湿藻体，冷冻干燥后称重计算生物量及生物量产率。生物量=干藻质量/藻液体积，生物量产率=生物量/培养时间。

使用血球计数板测量细胞浓度，取接种当天和培养结束时的细胞浓度计算比生长速率[11]。

1.2.3 油脂提取

培养至稳定期的藻液转移至离心管内，于8 000g离心5 min，去掉上清，将湿藻体放入-80℃冰箱中冷冻过夜后，冻干机上样冷冻干燥36 h，得到干藻粉。油脂提取采用Bligh & Dyer法[12]。称取干藻粉0.2 g、石英砂0.4 g，于研钵中研磨至细胞充分破碎油脂释放，将藻粉转移至5 mL EP管，向研钵中加入3 mL氯仿-甲醇以混合残留的藻粉，并转移到已装有干藻粉的EP管中，然后放置于摇床上，室温、100 r/min振荡提取20 min后，于2 000 r/min离心10 min收集溶剂相，剩余沉淀再用氯仿-甲醇重复提取2次，然后合并3次提取的溶剂相，40℃烘干48 h，冷却至室温后称重，计算油脂含量和油脂产率。

油脂含量=W1/W0×100%

油脂产率=W0×C/(V×T)

式中：W1为提取的油脂质量，mg；W0为藻粉干重，mg；C为油脂含量；V为藻液体积，L；T为培养时间，d。

1.2.4 脂肪酸组成分析及相关指标测定

将提取的油脂约100 mg加入2 mL 3%硫酸-甲醇充分混合，70℃水浴冷凝回流4 h，加入2 mL正己烷后置于摇床上，室温、100 r/min振荡萃取4 h，静置后取上清用0.45 μm有机相滤膜过滤，得到的脂肪酸甲酯(FAMEs)[13]进行GC-MS分析[11]。计算得单一脂肪酸对应十六烷值(CN)，根据脂肪酸组成再经过组合模型估测生物柴油的十六烷值[14]。

1.2.5 硝酸盐质量浓度测定

采用比色法测定藻液中胞外硝酸盐的质量浓度。取1 mL微藻培养基混合液，在13 000g下离心5 min，取100 μL上清液，与400 μL 5%的水杨酸-H2SO4溶液混溶，于室温反应20 min，缓慢加入9.5 mL 2 mol/L NaOH溶液，静置冷却至室温后，在410 nm处测量吸光度，计算硝酸盐质量浓度。

1.2.6 微藻沉降

单独培养及共培养藻液分别培养至稳定期，在自然条件和调节pH(利用1 mol/L HCl将培养后藻液pH调节至7.0)后进行沉降率测定，并与单独培养后添加絮凝剂的沉降率结果进行比较。

将自然条件、调节pH、添加絮凝剂的藻液转移至英霍夫沉降管(Imhoff Cones)[15]，沉降30 min，微藻液面下5 cm处取样，于750 nm、1 cm光程进行比色，计算沉降率(η)[16]。

η=(OD0-OD1)/OD0×100%

式中：OD0为开始沉降时藻液的光密度；OD1为沉降30 min时藻液的光密度。

1.2.7 统计分析

所有实验样品设置3组平行，所得实验数据采用Minitab软件进行分析。最小显著性差异进行多重比较检验研究不同实验的组间差异，且当p<0.05具有显著性意义，p<0.01具有极显著性意义。

2.3 不同TSH水平与TG及LDL-C的相关性分析 为进一步分析不同TSH水平与脂质代谢之间的相关性，将女性亚临床甲减人群以TSH 10 mIU/L为分界进行分层，并对不同TSH水平与TG及LDL-C的相关性进行Logistic回归分析，结果显示，TG水平与TSH水平显著相关，尤其是TSH>10mIU/L时TG升高的风险明显增加(β=1.84、OR=4.96、95%CI为1.83～13.51、P=0.002)，4.2 mIU/L

2 结果与分析

2.1 生长特性

不同培养体系的微藻生长曲线及硝酸盐消耗情况见图1。

由图1A可以看出，所有微藻生长均未出现明显的停滞期，用于接种的种子液状态良好，实验未出现杂菌污染现象。eh1单独培养26 d细胞浓度达到27.9×106个/mL；eh3单独培养26 d细胞浓度达到47.8×106个/mL；而eh1和eh3共培养20 d细胞浓度达到40.0×106个/mL。这是由于eh1和eh3共培养产生了环境内竞争关系，更快地消耗了培养基中的营养物质，在较短的时间进入了稳定期，缩短了生长周期和培养时间。由图1B可以看出，不同培养体系中的硝酸盐几乎都被耗尽，对比单独培养体系和共培养体系，共培养体系在16 d时已经消耗绝大部分硝酸盐，此时eh1单独培养体系中还剩余47%的硝酸盐，eh3单独培养体系中则为17%，这表示共培养体系更早地出现了氮缺陷现象从而进入了氮限制状态。这种情况的产生可能与共培养有关，共培养使得两种微藻产生了竞争关系，诱导其各自产生了单独培养下不会发生的代谢途径，产生了不同于单独培养下的代谢产物，在此过程中硝酸盐消耗速率提升。因此，共培养是一种可以缩短微藻生长周期及培养时间的培养方法。

2.2 油脂产率

微藻油脂生产能力是衡量微藻是否具备生物柴油生产能力的依据。一般油脂含量较高的微藻生物量较低，而生物量较高的微藻油脂含量较低[17]。本实验综合考量以上两个指标，选取油脂产率作为评价微藻油脂生产能力的标准。eh1和eh3单独培养26 d及共培养20 d的油脂产率见表1。

表1 Monoraphidium sp. eh1和Monoraphidium sp. eh3

由表1可以看出，eh3单独培养的生物量产率最低，共培养生物量产率最高，eh1单独培养的油脂含量最低，共培养的油脂含量最高，eh3的油脂产率最低，共培养的油脂产率最高。由于共培养氮源消耗较快而进入了氮限制状态，已有的研究[18]表明，氮限制能增加脂肪酸酰基Co-A的细胞内含量并激活二酰基甘油酰基转移酶，将脂肪酸酰基Co-A转化为甘油三酯，当微藻处于低氮含量培养基中时，其油脂含量会高于较高氮含量培养基中的微藻[19]，同时共培养缩短了培养时间，最终使得其油脂产率相较于单独培养有了很大的提升。

2.3 脂肪酸组成

本实验就各种培养体系获得的油脂进行了脂肪酸组成分析。另外，由于在沉降实验时对藻液pH进行了调节，为了明确pH是否会对油脂质量产生影响，将共培养的藻液调节pH(7.0)后进行了油脂的提取，并进行了脂肪酸组成分析，结果见表2。

表2 Monoraphidium sp. eh1和Monoraphidium sp. eh3单独培养及共培养微藻油脂脂肪酸组成及含量 %

2.4 微藻的沉降

沉降率是衡量微藻采收效率的标准之一，较高的沉降率表示在短时间内可以实现高效的采收。已有的提高微藻采收效率的方法中，添加絮凝剂是一种有效的手段。本实验对单独培养26 d的eh1和eh3添加不同种类和剂量的絮凝剂，并测定沉降率，结果见表3。

表3 Monoraphidium sp. eh1和Monoraphidium sp. eh3添加絮凝剂的沉降率

从表3可以看出，添加絮凝剂对eh1和eh3沉降率都有显著的提升。在已有的研究[20-22]中，添加絮凝剂是促进沉降的有效方法。在对小球藻(UTEX 265)的研究中[18]，添加400 mg/L FeCl3沉降率可达80%左右，低于本实验添加同等浓度FeCl3的eh3的沉降率92.85%，但添加600 mg/L FeCl3的沉降率最高为95%[18]，高于本实验添加同等浓度FeCl3的eh1的沉降率90.47%，而添加200 mg/L明矾的沉降率最高为20%[18]，本实验添加同等浓度明矾的eh1和eh3沉降率分别为90.46%和91.77%。在对螺旋藻(Spirulina)、小球藻(Chlorella)、颤藻(Oscillatoria)和蓝藻(Synechocystis)的研究[19]中，添加15 mg/L壳聚糖的沉降率最高为92%，低于本实验添加同等浓度壳聚糖的eh1的沉降率96.86%，但高于未出现沉降效果的eh3。在对栅藻(Scenedesmusquadricauda)的研究[22]中，添加40 mg/L的聚丙烯酰胺(阳离子)沉降率可达90%，低于本实验添加6 mg/L聚丙烯酰胺(阳离子)的eh1(99.80%)和eh3(97.11%)沉降率。絮凝剂用量的差异可能来自于藻种的不同和测量计算方法的差异，实验添加絮凝剂效果与已有研究大致相同。

同时，共培养调节pH也是一种高效的采收方式。微藻在不同条件(自然条件、添加絮凝剂和调节pH)下，eh1和eh3单独培养26 d及共培养20 d的沉降率见图2。

注：添加絮凝剂均为最优添加量下的沉降率。

由图2可见，自然条件下eh1、eh3单独培养和共培养30 min沉降率分别为10.01%、53.60%和50.78%。无论是单独培养还是共培养，在实验过程中并未产生明显的液面分层，结合沉降实验现象和数据认为自然条件下各组均不具有明显的沉降效果。调节pH为7.0后进行沉降实验，结果显示单独培养的eh1、eh3沉降率分别为16.40%和56.70%，无显著提升，而调节pH至7.0后的共培养体系沉降率可达到95.38%，较调节前的50.78%有显著提升，且与添加某些絮凝剂的沉降率持平，具有显著的沉降效果。

微藻在液体培养基中大多处于悬浮状态，并因其表面所带负电荷使得微藻细胞之间产生斥力，形成稳定的悬浊液，导致采收困难[16]。在本实验中，无论是单独培养，还是共培养均不能得到较好的沉降效果；添加絮凝剂后，无机絮凝剂(氯化铁和明矾)所带的阳离子Fe3+和Al3+等与微藻表面的负电荷中和，消除了表面斥力实现了去胶粒化，有机絮凝剂则发挥网捕和架桥作用，将藻体通过包裹或连结的方式聚集到一起结成块状，这都促进了微藻的絮凝沉降[22]；共培养后调节pH可以达到与添加絮凝剂相似的微藻细胞沉降效果，共培养使得不同微藻产生的代谢产物在藻体外形成胞外聚合物[23]，这些胞外聚合物通过网捕架桥作用将藻体聚集在一起实现絮凝，这在一定程度上增强了絮凝效果，而调节pH后消除了微藻表面所带电荷，使得藻体之间的斥力瓦解，进一步促进了藻体间的胞外聚合物将藻体絮凝成团，实现短时间内的快速沉降。

添加絮凝剂能够实现较好的采收，无机絮凝剂虽然价格较为低廉，但会对环境产生较大污染，需要进行严格的处理后才能排放，无形中增加微藻的采收成本；有机絮凝剂(聚丙烯酰胺(阳离子)和壳聚糖等)污染较小，但因其价格较高，一般多用于高附加值产品，所以添加絮凝剂的方法不适用于大规模微藻的采收。而共培养后调节pH的方法，对沉降率提升显著，与添加絮凝剂的沉降率接近，并且由于将藻液调节pH至中性，对环境造成的污染和破坏小，可以较大程度地降低采收后液体的后处理成本。

3 结 论

在油脂生产方面，共培养条件下的油脂产率较eh1、eh3单独培养分别提高了1.22倍和1.53倍，增加较显著；在采收方面，共培养后调节pH至7.0，30 min内沉降率达到95.38%，远超过单独培养条件下的沉降率，与添加絮凝剂的沉降率接近。微藻共培养结合调节pH为中性，是一种能有效提高油脂产率并降低采收成本的方法，具有较强实际应用价值。