萝卜硫素通过下调Cox-2/Akt/GSK3β信号传导抑制人皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖

杨丽亚 刘彩玉

萝卜硫素(sulforaphane)又称“莱菔子素”，属于异硫代氰酸盐衍生物，广泛存在于西兰花、花椰菜、甘蓝、萝卜及芥菜等十字花科植物。药理学研究发现，其具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎症及参与免疫调节等方面的功效[1-4]。对胃癌、结肠癌及肺癌等都有着较好的药理活性[5-7]；肿瘤的发生发展与环氧化酶-2(COX-2)的高表达密切相关，人皮肤鳞状细胞癌细胞中COX-2表达呈明显升高的趋势[8]。早期研究还提出COX-2的高表达还能诱导Akt/GSK3β信号传导[9]，并且后者还参与人皮肤鳞状细胞癌细胞的增殖、侵袭及迁移等生物学过程[10]。然而，目前关于萝卜硫素是否通过调节Cox-2/Akt/GSK3β信号通路活化，进而抑制人皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖的研究甚少。因此，本研究旨在观察萝卜硫素对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖及凋亡的影响，及萝卜硫素对Cox-2/Akt/GSK3β信号通路的影响。

1 材料及方法

1.1 主要材料 人皮肤鳞状细胞癌A431细胞株购自武汉巴菲尔生物有限公司；DMEM培养液、胎牛血清、胰蛋白酶购自Gibco公司；CCK8试剂盒购自Solarbio公司；RIPA裂解液购自杭州四季青公司；BCA蛋白定量试剂盒购自北京康为世纪；Annexin V/FITC细胞凋亡试剂盒购自北京四正柏生物公司；兔抗鼠Survivin、Casepase-3、Cox-2、Akt、p-Akt、GSK3β、p-GSK3β及β-actin抗体购自美国CST公司；羊抗兔IgG二抗购自上海谷歌生物公司；ELC化学发光检测试剂盒购自Advansta公司。

1.2 主要仪器 BIORAD-550型酶标仪(美国伯乐公司)；Amersham Imager 600仪器(BIO-RAD，美国)；FACSCalibur型流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)。

1.3 A431细胞培养 采用含10%胎牛血清和1%抗生素的DMEM培养基培养A431细胞，培养条件为5% CO2、37℃恒温。待细胞融合至90%左右，便进行传代培养。具体操作步骤如下：PBS清洗细胞2遍，加入胰蛋白酶消化细胞，待细胞变圆后加入培养基终止消化，转移至无菌Ep管中，1000 r/min离心5 min，弃去旧培养液，加入新鲜培养液重悬细胞进行后续实验。

1.4 CCK8实验 对数生长期的A431细胞接种至96孔板，每孔1×105个细胞，培养过夜后，加入不同浓度萝卜硫素(0、30、60、120 μM)、顺铂(3 μM)及顺铂+萝卜硫素(30、60、120 μM)处理细胞24 h。除去旧培养液，每孔加入20 μL CCK8试剂，放于恒温培养箱中继续培养2 h，酶标仪检测450 nm波长处的细胞吸光度A值，并计算细胞相对存活率(%)=A实验组/A对照组×100%。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 对数生长期的A431细胞接种至6孔板，每孔2×106个细胞，培养24 h后，加入不同浓度萝卜硫素(0、30、60、120 μM)、顺铂(3 μM)及顺铂+60 μM萝卜硫素处理细胞24 h。消化、离心、收集细胞，PBS清洗2次，离心后加入1×binding buffer制成细胞悬液，置于流式管，加Annexin V-FITC与PI 各5 μL，混匀后室温下避光孵育15 min，再加入1×binding buffer充分混合细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.6 Western Blot检测蛋白表达 按照“1.5”项操作进行药物干预，收集细胞冰上充分裂解30 min，BCA法测定总蛋白浓度，每孔上样50 μg进行凝胶电泳(恒压70 V，3 h)，待蛋白完全分离后进行蛋白转膜实验(恒流275 mA，70 min)，5%脱脂牛奶封闭蛋白条带1 h后，孵育一抗(Survivin、Casepase-3、Cox-2、Akt、p-Akt、GSK3β、p-GSK3β及β-actin，稀释比1∶1000)，4℃过夜，TBST洗膜3次，室温孵育二抗90 min(稀释比1∶3000)，TBST洗膜3次，ECL显色，暗室曝光。蛋白灰度值采用Image J软件进行分析。

1.7 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，组间差异采用单因素方差分析，P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 CCK8法测定萝卜硫素对A431细胞相对存活率的影响 低剂量(30 μM)萝卜硫素组A431细胞吸光度A值与对照组相比没有明显差异(P>0.05)，其余萝卜硫素组、顺铂组及顺铂+萝卜硫素组的A值均显著低于对照组(P<0.05)。顺铂+萝卜硫素组的A值均显著低于单纯顺铂组(P<0.05)；顺铂+萝卜硫素组的A值均显著低于同剂量萝卜硫素组(P<0.05)，见表1。

表1 不同组间A431细胞相对存活率比较

注：与对照组比较，1：P<0.05；与顺铂组比较，2：P<0.05；顺铂+萝卜硫素组与同剂量萝卜硫素组比较，3：P<0.05

2.2 萝卜硫素对A431细胞凋亡率的影响 A431细胞凋亡率主要体现在早期凋亡(见图2中右下象限)，对照组A431细胞凋亡率为(0.74±0.13)%，低、中、高剂量萝卜硫素组A431细胞凋亡率分别为(1.31±0.15)%、(2.72±0.0.19)%、(3.86±0.34)%，单纯顺铂组凋亡率为(5.46±0.49)%，顺铂+中剂量萝卜硫素组凋亡率为(7.95±0.61)%；不同剂量萝卜硫素组、单纯顺铂组及顺铂+中剂量萝卜硫素组A431细胞凋亡率均显著高于对照组(P<0.05)；随着萝卜硫素浓度的升高，细胞凋亡率也随之增高；顺铂+中剂量萝卜硫素组的早期凋亡率显著高于不同剂量萝卜硫素组(P<0.05)。

图1各组间A431细胞凋亡率的比较

2.3 萝卜硫素对A431细胞中Survivin和Casepase-3蛋白表达的影响 萝卜硫素对Survivin和Casepase-3蛋白表达的影响见表2、图2。各萝卜硫素组、顺铂组及顺铂+萝卜硫素组中Survivin表达水平相对于对照组均显著降低(P<0.05)，Caspase-3表达水平显著升高(P<0.05)；随着萝卜硫素剂量的增高，Survivin表达水平显著降低，Caspase-3表达水平显著升高，各组间差异有统计学意义(P<0.05)；单纯顺铂组Survivin表达量显著低于各萝卜硫素组，Caspase-3表达显著高于各萝卜硫素组(P<0.05)；顺铂+萝卜硫素组的Survivin表达显著高于各萝卜硫素和单纯顺铂组(P<0.05)。

表2 各组间Survivin和Casepase-3蛋白表达水平的比较

注：与对照组比较，1：P<0.05；与顺铂组比较，2：P<0.05；顺铂+萝卜硫素组与同剂量萝卜硫素组比较，3：P<0.05。

注：1：对照组，2：低剂量萝卜硫素组，3：中剂量萝卜硫素组，4：高剂量萝卜硫素组，5：单纯顺铂组，6：顺铂+中剂量萝卜硫素组。

图2萝卜硫素对A431细胞中Survivin和Casepase-3蛋白表达的影响

2.4 萝卜硫素对A431细胞中Cox-2/Akt/GSK3β信号通路的影响 萝卜硫素对Cox-2/Akt/GSK3β信号通路蛋白表达的影响见表3、图3。各萝卜硫素组、顺铂组及顺铂+萝卜硫素组中Cox-2、p-Akt及p-GSK3β表达水平相比于对照组均显著降低(P<0.05)；随着萝卜硫素剂量的增高，Cox-2、p-Akt及p-GSK3β表达水平显著降低，各组间差异有统计学意义(P<0.05)；单纯顺铂组Cox-2、p-Akt及p-GSK3β表达量显著低于各萝卜硫素组(P<0.05)；顺铂+萝卜硫素组的Cox-2、p-Akt及p-GSK3β表达显著低于各萝卜硫素和单纯顺铂组(P<0.05)。

表3 各组间Cox-2/Akt/GSK3β信号通路蛋白表达水平的比较

注：与对照组比较，1：P<0.05；与顺铂组比较，2：P<0.05；顺铂+萝卜硫素组与同剂量萝卜硫素组比较，3：P<0.05

注：1：对照组，2：低剂量萝卜硫素组，3：中剂量萝卜硫素组，4：高剂量萝卜硫素组，5：单纯顺铂组，6：顺铂+中剂量萝卜硫素组。

图3萝卜硫素对A431细胞中Cox-2/Akt/GSK3β信号通路的影响

3 讨论

萝卜硫素来源于十字花科植物，具有较强的抗肿瘤活性[5-7]。除此之外，萝卜硫素对多种皮肤性疾病有着较好的药理作用[11,12]，而对于人皮肤鳞状细胞癌的辅助治疗是否具有潜在价值，需进一步研究。因此，本实验以人皮肤鳞状细胞癌A431细胞为体外研究模型，观察了萝卜硫素对A431细胞增殖、凋亡的影响，并初步探讨了其作用机制。肿瘤发病机制不仅与癌细胞增殖、分化异常相关，还与细胞凋亡受阻有关。因此，阻滞肿瘤细胞增殖、诱导其凋亡可能是防治癌症的主要手段[13]。已有研究证实，萝卜硫素可通过诱导癌细胞凋亡、抑制细胞DNA合成、提升机体细胞免疫力等方面起着抗肿瘤的功效[14]。

细胞凋亡由基因调控的细胞自主程序性死亡，多种基因活化可调节此生物学效应。凋亡途径包含死亡受体途径及线粒体途径，它们均能引起效应性Caspase-3活化，进而导致内切核酸酶激活，诱导细胞凋亡发生[15,16]。Caspase是调控细胞凋亡的主要蛋白，而Survivin蛋白属于抑制凋亡蛋白，主要通过抑制Caspase-3和Caspase-7活性阻断细胞凋亡，并且上述蛋白表达水平与人皮肤鳞状细胞癌细胞的增殖、凋亡相关密切[17,18]。

以A431细胞增殖、凋亡为切入点，进一步观察萝卜硫素作用的分子机制。CCK8法实验结果提示，萝卜硫素呈浓度依赖性抑制A431细胞增殖，然而，不同剂量萝卜硫素对A431细胞的生长抑制作用不及单纯顺铂和顺铂+萝卜硫素组，二者表现出协同作用。细胞凋亡实验结果提示，不同剂量萝卜硫素组、单纯顺铂组和顺铂+萝卜硫素组均能引发A431细胞的早期凋亡，并且细胞早期凋亡率与萝卜硫素剂量呈明显正相关，顺铂+萝卜硫素联合给药引起的细胞凋亡高于单纯萝卜硫素组和单纯顺铂组，二者联合用药有协同作用。Western Blot实验显示萝卜硫素、顺铂及联合给药能显著降低Survivin蛋白表达量，诱导Caspase-3蛋白表达。

Cox-2在人皮肤鳞状细胞癌细胞中呈高表达状态[10]，早期研究已证实Cox-2可诱导Akt磷酸化[20]，进一步促使GSK-3β磷酸化[12]，该信号传导的激活能调节细胞增殖、黏附、分化及凋亡等过程。本文研究也发现不同剂量萝卜硫素组、单纯顺铂组和顺铂+萝卜硫素组均能显著抑制Cox-2、p-Akt及p-GSK-3β表达，并且Cox-2、p-Akt及p-GSK-3β表达量与萝卜硫素剂量呈明显正相关，顺铂+萝卜硫素联合给药抑制作用明显高于单纯萝卜硫素和单纯顺铂组，二者联合用药有协同作用。

综上所述，萝卜硫素可通过诱导人皮肤鳞状细胞癌细胞凋亡、抑制其增殖起着抗癌的活性，该生物学效应可能与抑制Cox-2/Ak/GSK-3β信号传导、上调Caspase-3及下调Survivin蛋白表达相关。