葛根芩连汤对2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗及炎性因子的影响

闫忠红，刘 勇，刘 硕，胡新颖

（黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040）

近年来，糖尿病尤其是2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的发病率逐年上升，已成为全球非传染性疾病中最具流行性的疾病之一[1]，其预后差，并发症多，严重危害人类健康。中医方剂在糖尿病的治疗中独居特色，具有疗效显著、长期使用副作用小的特点，有着西药不可替代的优势，可多途径、多靶点改善组织器官功能[2]。葛根芩连汤为中医经典方剂，临床运用该方治疗T2DM取得了较好的降糖效果[3]，实验研究亦证实其具有改善T2DM大鼠胰岛素抵抗作用[4]。网络药理学揭示葛根芩连汤治疗2型糖尿病的效应机制多与抗炎、抗氧化应激等相关[5]。对自发性2型糖尿病肥胖大鼠模型研究，亦表明葛根芩连汤具有改善胰岛素抵抗作用和调节炎症细胞子的作用[6]。由此可见，细胞因子与葛根芩连汤治疗T2DM相关。为此，本实验采用高脂高糖饮食饲养加注射小剂量链脲佐菌素复制2型糖尿病模型，探讨葛根芩连汤对T2DM模型大鼠胰岛素抵抗及炎性因子的影响，为葛根芩连汤通过调节炎症细胞因子而改善T2DM胰岛素抵抗提供实验依据。

1 材料

1.1 实验动物 SPF级健康SD雄性大鼠40只，体质量（180～200） g，6～8周龄，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK（黑）2013-012。常规条件饲养，按正常昼夜节律调节光照时间，保持室温22～26℃，湿度50%～60%。

1.2 药物 葛根芩连汤，由葛根、黄芩、黄连、炙甘草组成，购自黑龙江中医药大学附属第一医院中药局，由黑龙江中医药大学实验中心加工制备呈汤剂，使用前37 ℃水浴加热。马来酸罗格列酮（文迪雅），购自葛兰素史克（天津）有限公司，国药准字H20020475。

1.3 主要试剂与仪器 链脲佐菌素（STZ），购自美国Sigma公司；胰岛素放射免疫试剂盒，购自北京华英生物有限公司；TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1 ELISA试剂盒，购自美国R&D公司。AL204电子天平，购自瑞士METTLEY TOLEDO公司；血糖仪，购自上海鱼跃医疗设备公司；Fresco低温冷冻离心机，购自美国Thermo公司；MultiSkan3酶标仪，购自美国Thermo公司；微量移液器，购自德国Eppendorf公司。

2 方法

2.1 模型制备及分组 将40只SD大鼠，适应性喂养1周后，随机分为空白组（10只）和造模组（30只），分别给予普通饲料和高脂高糖饲料[7]（鼠维持饲料67.5%、猪油10%、蔗糖20%、蛋黄粉2.5%）喂养。连续喂养4周后，造模组大鼠空腹一次性腹腔注射pH 4.4枸橼酸钠缓冲液配制的STZ溶液30 mg/kg。7 d后经大鼠尾静脉取血，取血前大鼠禁食不禁水12 h，然后用血糖仪检测大鼠空腹血糖（fasting blood glucose，FBG），将血糖值在16.7 mmol/L至30 mmol/L范围的大鼠视为模型成功。将造模成功大鼠随机分为模型组，罗格列酮组和葛根芩连汤组，每组10只大鼠。

2.2 给药方法 分组第2天，各组大鼠经灌胃给药，给药量依照人与大鼠给药剂量系数折算公式，空白组和模型组给予0.9%氯化钠溶液（10 mL/kg），罗格列酮组和葛根芩连汤组分别给予罗格列酮溶液3 mg/kg和葛根芩连汤18.2 g/kg灌胃，用药体积按100 g体质量1 mL计算，1次/d，连续4周。

2.3 标本采集 治疗结束后，禁食不禁水12 h，所有大鼠快速剪尾取血，用血糖仪测量FBG。然后麻醉各组大鼠，经腹主动脉取血，取血完成后将采血管静置30 min，放入高速离心机中以3 500 r/min离心15 min，分离血清，使用微量移液枪收集上清液移入不同编号的EP管，将其放置- 20℃冰箱冻存，待检测。

2.4 指标检测

2.4.1 血清胰岛素（fasting insulin，FINS）测定 使用放射免疫法检测各组大鼠FINS含量，严格按照试剂盒说明书操作，分别将各组大鼠血清及标准品各100 μL加入聚苯乙烯试管并编号，各管分别加入抗体与125I-Ins各100 μL，充分混匀，37 ℃温育2 h；各管中加入500 μL免疫分离剂混匀后于3 500 r/min离心15 min，摒弃上清液，检测沉淀的CPM值，计算各组大鼠FINS水平。计算胰岛素抵抗指数（homeostasismodel assessment-estimated insulin resistance，HOMAIR）：HOMA-IR=（FBG×FINS）/22.5。

2.4.2 大鼠血清炎性因子水平检测 用 ELISA法检测大鼠血清炎性因子肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素 -6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素 -1β（interleukin-1β，IL-1β）以及单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein，MCP-1）含量。操作步骤严格按照 ELISA试剂盒说明书进行，稀释标准品后加样，盖封膜板摇匀后，恒温温育60 min，洗涤后加入显色剂，恒温避光显色 12 min，加入终止液，10 min后采用酶标仪依序测量各孔的吸光度。

2.5 统计学方法 本实验所有数据均采用SPSS 17.0软件进行分析，以均数±标准差（±s）表示。采用单因素方差分析进行数据处理，采用LSD进行两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠FBG、FINS、HOMA-IR的比较 见表1。

表1 各组大鼠FBG、FINS、HOMA-IR的比较（± s ，n = 10）

表1 各组大鼠FBG、FINS、HOMA-IR的比较（± s ，n = 10）

注：与空白组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组 别FBG/（mmol/L）FINS/（mIU/L）HOMA-IR空白组 5.12±0.53 14.89±3.83 3.40±0.78模型组 24.26±5.02# 21.09±2.36# 23.01±5.34#罗格列酮组 17.36±4.05△ 17.69±2.05△ 13.65±5.14△葛根芩连汤组 20.58±2.83 18.01±2.98△△ 16.47±3.68△

3.2 各组大鼠血清炎性因子的比较 见表2。

表2 各组大鼠血清炎性因子的比较（± s ，n = 10）

表2 各组大鼠血清炎性因子的比较（± s ，n = 10）

注：与空白组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

组 别 TNF-α/（pg/mL） IL-6/（pg/mL） IL-1β/（pg/mL） MCP-1/（ng/mL）空白组 0.45±0.69 3.45±0.54 60.20±8.24 129.64±11.68模型组 2.02±1.02# 8.89±1.75# 129.89±22.69# 179.54±27.86#罗格列酮组 0.98±0.25△ 5.32±1.30△ 89.86±9.74△ 148.47±12.04△葛根芩连汤组 1.24±0.47 6.69±1.47△ 93.66±14.98△ 158.25±10.34

4 讨论

T2DM为西医学病名，在祖国医学中当属“消渴”范畴，其发生发展与先天不足、后天饮食不节、情志失调、过度劳逸等因素密切相关，其基本病机为胃肠湿热、燥热伤津。葛根芩连汤出自《伤寒论》，主要用于治疗湿热所导致的痢疾和腹泻，根据中医异病同治的思想，将其用于治疗T2DM，取得了良好的临床疗效。

胰岛素抵抗贯穿T2DM发生发展的整个过程，是T2DM的始动因素和主要机制[8]。胰岛素抵抗发生时，胰岛素促进葡萄糖摄取作用受损，导致胰岛素代偿性增多，因此改善胰岛素抵抗是治疗T2DM的关键。胰岛素抵抗被认为是低度炎症状态[9]，炎性反应是引起胰岛素抵抗的重要因素之一[10]。在炎症反应发生时，通过内分泌和旁分泌途径分泌多种炎性因子，引起胰岛素信号转导受阻从而诱发机体胰岛素抵抗[11]。长期胰岛素抵抗会引起机体一系列病理改变，大量文献表明，TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1这些炎症因子均能直接或通过相互作用导致胰岛素抵抗[12-14]。炎症和胰岛素抵抗关系密切，相互影响，相互调控，因此降低炎性因子水平能起到提高胰岛素敏感性和保护胰岛细胞存活的作用。

本实验观察到，与空白组比较，模型组大鼠血清FBG、FINS、HOMA-IR明显升高，与以往文献报道一致[15]，提示模型组大鼠造模成功。同时，模型组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1水平亦明显提高，提示T2DM处于慢性炎症状态，这种炎症反应可引起相应脏器的损伤[16]。经过4周的连续给药治疗，与模型组比较，葛根芩连汤组FINS 含量和HOMA-I R显著下降（P＜0.05），提示葛根芩连汤可改善T2DM的胰岛素抵抗，主要是提高胰岛素的敏感性。与模型组比较，葛根芩连汤组FBG下降（20.58比24.26），但无显著性差异（P＞0.05）,与以往文献实验结果不一致[17]，可能时由于本实验中采用的T2DM大鼠模型变异较大，样本数不足所致。系统药理学，网络药理学和代谢组学研究均表明[4-5,18]，葛根芩连汤通过多途径，多靶点发挥治疗T2DM作用。近些年，葛根芩连汤在治疗肠道炎症发挥了重要的作用，可明显抑制多种炎症细胞因子的产生[19-20]。与模型组比较，葛根芩连汤组大鼠血清IL-6和IL-1β水平明显降低，提示葛根芩连汤可能通过降低血清炎性因子水平，改善T2DM大鼠胰岛素抵抗。综上所述，T2DM大鼠血清炎性因子水平升高可能导致胰岛素抵抗，进而升高大鼠血糖；葛根芩连汤可能通过降低T2DM大鼠血清炎性因子水平，发挥改善胰岛素抵抗的作用，进而降低大鼠血糖。葛根芩连汤的降糖作用可能与降低血清炎性因子水平，从而改善T2DM大鼠胰岛素抵抗有关。