FGF21对Aβ25-35导致星形胶质细胞损伤的保护作用及机制研究

孙 岩，高向东，陈 松

（中国药科大学生命科学与技术学院江苏省生物药物成药性研究重点实验室，南京211198）

阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是一种神经退行性疾病，也是最为常见的痴呆形式之一，其主要的发病特征为认知记忆能力障碍，学习行为能力下降。目前主要的病理特点为β-淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）积聚在脑实质和血管系统中并形成老年斑块，以及异常磷酸化的tau蛋白沉积形成神经纤维缠结，进一步导致了突触功能变性、神经元氧化损伤、线粒体功能障碍等［1-2］。随着全球老龄化程度的加剧，AD的患病率逐年攀升，其发病特点呈现多因素且发病机制目前尚不明确，患者的病情进展变化较大。因此，对AD的发病机制、预防措施及治疗方案等相关的研究越来越多受到人们的重视。

在中枢神经系统中，星形胶质细胞主要参与神经元自身代谢及神经突触传递的能量供给途径，其在复杂的脑能量代谢中占有较为重要的位置。有研究报道，在大鼠空间学习和记忆的过程中，脑内星形胶质细胞的数量呈现增加的趋势［3］。Suzuki等［4］发现在大鼠海马区中，长期记忆的形成对神经元有较高的能量需求，而星形胶质细胞糖原代谢在此过程中为神经元提供了主要的能量源。同时星形胶质细胞功能异常则可能在AD发生发展中具有重要作用［5］。近年来AD也被称3型糖尿病，患者体内产生胰岛素抵抗效应进而对脑能量代谢和认知功能产生影响［6］。成纤维细胞生长因子21（fibroblast growth factor 21，FGF21）是成纤维细胞生长因子亚家族成员，在中枢神经系统脑能量代谢中可能发挥一定的潜在作用，但在AD中及其对星形胶质细胞的作用尚不明确。

本研究通过对星形胶质细胞建立AD样损伤模型，重点考察FGF21对星形胶质细胞的细胞活性及胞内活性氧水平的影响，探讨其对MAPKs信号通路的调节作用，明确FGF21对AD中星形胶质细胞的保护作用。

1 材 料

1.1 试 剂

FGF21（本实验室制备）；Aβ25-35（中国吉尔生化有限公司）；活性氧 ROS（reactive oxygen species）检测试剂盒、BCA蛋白浓度检测试剂盒、RIPA细胞裂解液、一抗稀释液（中国碧云天生物技术研究所）；DMEM高糖培养基、DMEM-F12培养基、胎牛血清（美国Gibco公司）；胰蛋白酶、MTT、氨苄西林钠、链霉素钠、牛血清白蛋白（中国 Biosharp公司）；磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、PVDF膜、ECL试剂盒（美国Millipore公司）；蛋白预染Marker（美国 Thermo公司）；β-actin抗体（中国 Abclonal公司）；p-MEK1／2抗体、MEK1／2抗体、p-ERK1／2抗体、ERK1／2抗体、p-p38抗体、p38抗体、Goat羊兔抗IgG、Goat羊鼠抗 IgG（美国 Cell Signaling Technology公司）；其他试剂均为市售分析纯。

1.2 仪 器

细胞培养箱、高速冷冻离心机、全波长酶标仪（美国Thermo公司）；立式压力蒸汽灭菌器（中国上海申安医疗器械厂）；流式细胞仪（美国Becton-Dickinson公司）；电泳仪、转膜仪（美国Bio-Rad公司）；多功能凝胶成像系统（中国Tanon公司）。

1.3 动物与细胞

Wistar大鼠，雌性，孕期18 d，由扬州大学比较医学中心提供，许可证号：SCXK（苏）2017-0007；星形胶质细胞瘤C6细胞株购自中国科学院上海细胞库。

2 方 法

2.1 细胞培养

C6细胞在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中贴壁生长，待汇合度达到80%～90%时进行传代培养，细胞培养箱环境维持在37℃、5%CO2饱和湿度条件。

2.2 原代星形胶质细胞培养

预先在细胞培养瓶内加入适量50μg／mL多聚赖氨酸溶液，过夜包被吸除后晾干，PBS洗涤3次。取新生24 h内的Wistar乳鼠，置于75%酒精中全身消毒，超净台内冰上取脑半球，充分剪碎组织，转移到含有10%FBS的DMEM-F12培养基中，1 000 r／min离心 5 min，弃上清液，加入0.125%胰酶4 mL于37℃培养箱内消化10 min，中间吹打1次。待消化完全后，加入含有10%FBS的DMEM-F12培养基终止消化，轻轻吹打后1 000 r／min离心5 min，弃上清液，重悬后过200目筛网得到单细胞悬液。将细胞悬液均匀铺在细胞培养瓶中，于37℃、5%CO2恒温培养箱内培养。24 h后首次换液，以后每隔2天换液1次。待培养至第7天，220 r／min细胞摇床中4 h进行细胞纯化即为原代星形胶质细胞，传代后进行实验。

2.3 Aβ25-35寡聚体的制备

Aβ25-35粉末充分溶解在双蒸水配制为终浓度为1 mg／mL的溶液。0.22μm无菌滤器滤过除菌，分装后置于37℃恒温培养箱内4 d，BCA法测定Aβ25-35寡聚体浓度，-20℃保存。

2.4 Aβ25-35致C6细胞损伤模型建立

C6细胞制成密度为每毫升5×104个的细胞悬液，充分混匀后以每孔100μL种植在96孔细胞培养板内，6 h后以梯度浓度 1，0.5，0.25，0.125，0.062 5，0.031 2，0.015 6，0.007 8μmol／L的Aβ25-35孵育 C6细胞24 h／48 h，MTT法检测细胞活性：每孔加入MTT 10μL，37℃恒温培养箱放置4 h后吸弃培养基，加入DMSO 150μL并置于摇床以500 r／min振摇10min充分溶解，570 nm检测波长，630 nm参比波长条件下酶标仪检测各孔内吸收度。

2.5 FGF21对Aβ25-35致C6细胞损伤的干预作用

培养 C6细胞，选取 0.062 5μmol／L Aβ25-35损伤C6细胞24 h后，不同浓度FGF21干预损伤后的C6细胞 24 h／48 h，浓度分别为：8，4，2，1，0.5，0.25，0.125μmol／L，MTT法检测各组细胞活性。

2.6 FGF21对Aβ25-35致原代星形胶质细胞损伤的干预作用

将培养好的原代星形胶质细胞制成密度为每毫升5×104个的细胞悬液，种植在96孔细胞培养板中，每孔体积100μL。6 h后使用终浓度为 5μmol／L的 Aβ25-35与细胞共孵育 24 h，以8μmol／L FGF21进行干预48 h，MTT法检测各组细胞活性。

2.7 DCFH-DA探针法检测Aβ25-35及FGF21对C6细胞内ROS生成水平的影响

实验分组为：空白组、FGF21单独给药组、Aβ25-35损伤模型组、FGF21+Aβ25-35损伤后给药组。收集状态良好的C6细胞，以每毫升5×104个的密度接种在6孔板内，每孔1mL，选择0.062 5μmol／L Aβ25-35损伤C6细胞24 h后，以8μmol／L FGF21给药干预48 h。采用DCFH-DA探针标记法流式检测C6细胞内ROS水平。具体步骤：吸弃6孔板内培养基，0.25%胰蛋白酶消化2 min，DMEM高糖培养基将细胞轻缓吹落并收集在EP管内，1 500 r／min离心5 min弃除上清液，按1∶1 000的比例以无血清的DMEM高糖培养基稀释配制成终浓度为10μmol／L的DCFH-DA溶液，每管加入重悬细胞1 mL，37℃孵育20 min，离心收集细胞，无血清DMEM高糖培养基洗涤，重复3次，流式细胞仪检测各组细胞荧光强度。

2.8 Western blot检测Aβ25-35及FGF21对C6细胞MAPKs信号通路的影响

按照“2.7”项下的实验分组及细胞培养方法，给药干预48 h后，提取细胞总蛋白，Western blot检测 各 实 验 组 p-MEK1／2、MEK1／2、p-ERK1／2、ERK1／2、β-actin、p-p38、p38蛋白水平变化。具体步骤：PBS洗涤细胞3次，加入RIPA细胞裂解液（按1∶200加入蛋白酶抑制剂，1∶100加入磷酸酶抑制剂）于冰上裂解，细胞刮刀收集细胞于EP管中，涡旋仪充分振荡裂解，12 000 r／min离心10 min取上清液即为细胞总蛋白。 进 行 SDSPAGE电泳，半干法恒流转膜6～8 min，转印后的PVDF膜以3%BSA封闭2 h，TBST洗涤5次，每次5 min，4℃过夜孵育一抗，重复洗涤后孵育二抗1.5 h，ECL显色成像，检测目标蛋白变化。

2.9 统计分析

实验数据采用GraphPad 7.0分析软件进行统计分析，各项指标以±s表示，以One-way ANOVA检验进行组间比较，P＜0.05时表明差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 Aβ25-35致C6细胞损伤模型建立

以不同浓度Aβ25-35损伤C6细胞24 h／48 h后，MTT检测细胞活性。结果如图1所示，Aβ25-35对C6细胞活性损伤呈现一定的浓度依赖性，作用48 h后C6细胞损伤程度较强于24 h。当0.062 5μmol／L Aβ25-35作用C6细胞24 h时，与空白对照组相比，细胞损伤率约为40%，因此选取Aβ25-35的最终造模浓度为0.062 5μmol／L。

Figure 1 Effects of different concentrations of Aβ25-35 on C6 cell viability for 24 h（A）／48 h（B）were estimated by MTT assay（±s，n=6）***P＜0.001 vs control group

3.2 FGF21对Aβ25-35致C6细胞损伤的干预作用

根据“3.1”项实验结果，以 0.062 5μmol／L Aβ25-35损伤 C6细胞 24 h后，分别与梯度浓度FGF21孵育C6细胞24 h／48 h后，MTT检测细胞活性。结果如图2所示，单独给予FGF21组与空白对照组相比较无明显差异，Aβ25-35模型组与空白对照组相比细胞活性有极显著差异，FGF21浓度为8μmol／L时，损伤后给药组与模型组相比细胞活性有显著差异。

Figure 2 Protective effect of FGF21 against Aβ25-35-induced toxicity on C6 cells.C6 cellswere treated with Aβ25-35（0.062 5μmol／L）and different concentrations of FGF21，and cell viabilities for 24 h（A）／48 h（B）were estimated by MTT assay（±s，n=6）＃＃＃P＜0.001 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs Aβ25-35 group

3.3 FGF21对Aβ25-35致原代星形胶质细胞损伤的干预作用

采用5μmol／L Aβ25-35损伤原代星形胶质细胞24 h后，8μmol／L FGF21干预48 h，MTT检测细胞活性。结果如图3所示，与模型组相比，给药组原代星形胶质细胞的细胞活力极显著升高，说明FGF21对Aβ25-35导致损伤的原代星形胶质细胞发挥了保护作用。

3.4 Aβ25-35及FGF21对C6细胞内ROS生成水平的影响

Figure 3 Protective effect of FGF21 against Aβ25-35-induced toxicity on primary astrocytes.Primary astrocytes were treated with Aβ25-35（5μmol／L）and FGF21（8μmol／L），and cell viabilities were estimated by MTT assay（±s，n=6）＃＃＃P＜0.001 vs control group；***P＜0.001 vs Aβ25-35 group

采用0.062 5μmol／L Aβ25-35损伤C6细胞24 h后，8μmol／L FGF21进行干预48 h，DCFH-DA探针法检测C6细胞内ROS水平。结果如图4所示：与空白对照组相比，Aβ25-35损伤后C6细胞内ROS极显著增加，而FGF21给药组与模型组相比ROS极显著降低，说明FGF21可缓解Aβ25-35引起的C6细胞内ROS水平异常，对细胞发挥了一定的相关保护作用。

Figure 4 FGF21 prevents Aβ25-35-induced abnormal ROS production.C6 cells were exposed to DCFH-DA analyzing ROS generation（±s，n=6）A：Analysis of ROS levels in C6 cells by flow cytometry；B：Quantification of ROS levels＃＃＃P＜0.001 vs control group；***P＜0.001 vs Aβ25-35 group

3.5 Aβ25-35及 FGF21对 C6细胞 ERK1／2通路的影响

采用Aβ25-35对C6细胞损伤并进行FGF21干预，Western blot检测各实验组 MEK1／2、ERK1／2磷酸化程度。结果如图5所示：与空白对照组相比，Aβ25-35损伤后 C6细胞中 MEK1／2、ERK1／2磷酸化水平异常升高，而 FGF21能缓解模型组MEK1／2、ERK1／2磷酸化水平异常。说明 FGF21可能通过C6细胞内MEK1／2／ERK1／2通路发挥细胞保护作用。

Figure 5 Effects of FGF21／Aβ25-35 on the phosphorylation levels of MEK1／2 and ERK1／2.In C6 cells，the abnormal phosphorylation levels of MEK1／2 and ERK1／2 were induced by Aβ25-35，and were regulated by FGF21-treatment（±s，n=3）A：Detection of phosphorylation levels of MEK1／2 and ERK1／2 by Western blot；B／C：Quantitative anlaysis of phosphorylation levels of MEK1／2 and ERK1／2＃＃＃P＜0.001，＃＃P＜0.01 vs control group；***P＜0.001 vs Aβ25-35 group

3.6 Aβ25-35及 FGF21对 C6细胞 p-p38和 p38的影响

Aβ25-35对C6细胞损伤造模，采用FGF21进行干预，Western blot检测各实验组p38磷酸化程度。结果如图6所示：与空白对照组相比，Aβ25-35损伤后C6细胞中p38磷酸化水平升高，而FGF21能一定程度上缓解模型组p38磷酸化水平异常。说明FGF21能调控Aβ25-35损伤后C6细胞内p38通路异常。MAPKs通路可能在 FGF21减少 Aβ25-35导致C6细胞损伤中具有重要作用。

4 讨 论

成纤维细胞生长因子21是庞大的FGF基因家族的一员，并具有多个不同于经典FGF家族的特点［7］。目前，以FGF21为代表的FGF亚家族成员已成为糖脂代谢研究的热点［8］。研究表明FGF21可通过简单扩散的方式透过血脑脊液屏障［9］，同时FGF21及其相应的受体在中枢神经系统中有一定的表达［10］。有研究报道FGF21能改善肥胖大鼠认知障碍，改构后的FGF21可缓解神经元的氧化损伤［11-12］。然而，FGF21在AD中具体作用机制及其对星形胶质细胞的影响仍有待进一步研究。脑内淀粉样蛋白沉积的发生先于神经原纤维缠结的形成、神经元细胞的死亡及继发的功能衰退［13］。目前，对AD的研究普遍认为Aβ的产生和积累仍是可能导致AD发生发展的主要机制之一［14-15］。Aβ聚集后引发淀粉样蛋白假说中相关的分子和细胞级联反应，导致突触功能的改变，小神经胶质细胞和星形胶质细胞的异常。本研究采用Aβ25-35模拟细胞AD相关的损伤，探索FGF21对细胞活性的影响，结果表明FGF21能够显著降低Aβ25-35所导致的原代星形胶质细胞及C6细胞株损伤，提高星形胶质细胞活力。说明FGF21对星形胶质细胞发挥了一定的保护作用。

Figure 6 Effects of FGF21／Aβ25-35 on the phosphorylation level of p38.The abnormal phosphorylation level of p38 was induced by Aβ25-35，and was regulated by FGF21-treatment in C6 cells（±s，n=3）A：Detection of phosphorylation levels of p38 by Western blot；B：Quantitative analysis of phosphorylation levels of p38＃P＜0.05 vs control group；*P＜0.05 vs Aβ25-35 group

氧化应激在神经退行性疾病早期中扮演着重要的角色，老年痴呆患者产生过量的自由基引发细胞进入氧化应激的病变状态，降低细胞活力。受损的星形胶质细胞首先产生多种促炎因子和神经毒性分子，一方面对神经元产生一定毒性，另一方面进而影响记忆形成进程，因此降低胶质细胞内氧化应激水平对于防治AD具有重要意义［16-18］。研究表明Aβ可诱导脑内产生过量的ROS，异常激活MAPKs信号通路，进而影响细胞的存活率［19］。也有研究发现发生AD病变后MAPK-ERK通路异常变化，导致海马功能受损诱发记忆障碍［20-21］。本研究表明FGF21可改善Aβ25-35导致的C6细胞内ROS水平异常，对AD相关的C6细胞损伤能发挥一定的保护作用，同时FGF21可能是通过缓解Aβ25-35引起的 MEK1／2、ERK1／2、p38异常进而减少C6细胞损伤。说明在AD相关的细胞损伤病变中，FGF21可能通过调节ROS途径及MAPKs信号通路，调控星形胶质细胞氧化应激水平，进而对星形胶质细胞发挥重要保护作用。