白藜芦醇对脂多糖诱导小鼠脑氧化损伤预防作用研究

陈红玲,高贵珍,王 晴,段 红,龙 涛,杜菲凡

宿州学院生物与食品工程学院，安徽宿州，234000

机体的衰老是个变化而复杂的过程，氧自由基导致的氧化损伤所引起的机体细胞的功能紊乱在其中起着很大作用，而脑组织耗氧量较大，又由于其含有单胺氧化酶等特性，导致氧自由基所引起的氧化损伤在脑组织更为明显[1-2]。

白藜芦醇是植物中的天然抗氧化剂，有较强的抗自由基、抗氧化作用[3-6]。2006年,Valenzano等人发现白藜芦醇可以增加脊椎动物的寿命[7]。王长本等人使用避暗试验观察白藜芦醇对小鼠记忆学习能力的影响，该试验在常压耐缺氧和亚硝酸钠中毒等造成的缺氧情况下观察白藜芦醇对小鼠缺氧的耐力影响。试验表明,白藜芦醇能显著增强小鼠的记忆能力和改善记忆障碍。通过耐力试验还表明,白藜芦醇可显著延长小鼠缺氧时间、提高鼠耐力和抗疲劳能力，以证明白藜芦醇具有良好的抗衰老的作用[8]。胥德政的研究结果显示,白藜芦醇能够较有效地清除自由基和抗脂质过氧化效应，其生理活性明显强于自由基清除剂维生素E和维生素C的生理活性[9]。目前试验研究表明,白藜芦醇主要通过清除或抑制自由基的生成、抑制脂质过氧化和调节抗氧化相关酶活性等机制来发挥抗氧化作用，延缓机体的组织氧化损伤过程，进而起到延缓和抗衰老作用。

脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁上的特有结构，脂多糖本身并没有毒性作用，但能够刺激体内各种细胞合成并释放众多内源性生物活性因子，导致大量的一氧化氮(NO)和炎性细胞因子的释放，而产生的NO及其衍生物可以引起宿主组织的氧化损伤和毒性作用。另外，NO是在一氧化氮合酶(NOS)的催化下产生的。NOS的作用是促进脑皮层和海马在LPS刺激下产生大量的NO，过量的NO与过氧化物一起导致过氧化,从而引起组织的氧化损伤[ 10]。当组织缺氧缺血时,在辅酶II氧化酶作用下还原型辅酶II(NADPH) →NADP+(氧化型辅II),而则接受一个电子成为超氧阴离子自由基。超氧化物歧化酶(SOD)是自由基的消除剂。丙二醛(MDA)是自由基引发的脂质过氧化反应的一种产物,其水平可反映体内自由基含量。

本试验采用的是LPS诱导氧化损伤模型，研究白藜芦醇对脂多糖(LPS)诱导的ICR小鼠脑皮层和海马中NOS活性的影响和白藜芦醇的抗氧化损伤保护机制(SOD酶活性和MDA含量)，旨在为白藜芦醇在抗机体氧化损伤的研究和临床应用中提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设备

1.1.1 试验材料

ICR品系小鼠(雄性，6～8周龄，购于徐州医学院动物部)、LPS(脂多糖，sigma公司)、白藜芦醇(天津一方生物制剂公司)、生理盐水(安徽环球药业股份有限公司)、NOS试剂盒(南京建成生物工程公司)、小鼠的饲料、考马斯亮蓝G250 、蒸馏水 、乙醚等购于国药集团，分析纯。

1.1.2 仪器设备

酶标仪(Multiskan G0 美国Thermo公司)、台式冷冻离心机(力康发展有限公司 型号Neofuge 23R)、组织匀浆器(cryomill，Retsch GmbH)、雪花制冰机 、电子天平(FA2004N型)、-80 ℃的冰箱、eppendorf管、96孔板 、各种移液枪及枪头、纯水仪 、离心管、灭菌锅、一次性无菌注射器等。

1.2 试验方法

1.2.1 试验动物

ICR小鼠，雄性，体重30～40 g,于室内分笼喂养，自由进食进水，待小鼠适应后进行试验。将小鼠随机分成三组，即：对照组(生理盐水，n= 6)、模型组(LPS，n= 6)、预防组(Res+LPS，n=6)。模型组前10天采用腹腔注射的方式注射生理盐水，然后注射LPS 5 mg/kg，连续2天。对照组注射等量的对照液(生理盐水)。预防组前10天按每天10 mg/kg体重腹腔注射白藜芦醇，在之后2天中预防组给药后采用腹腔注射LPS 5 mg/kg，对照组注射等量的生理盐水。

1.2.2 组织匀浆

处死：在最后一次给药48 h后，应用乙醚将动物深度麻醉，然后放置在冰浴中断颈处死。用乙醇消毒后的手术器材引颈剪开皮肤，取出完整的脑，并将脑皮层和海马分开称重。取出后立刻将这些组织放入eppendorf管中，保存在液氮中。待所有的小鼠脑皮层和海马组织都取完后，放入-80 ℃冰箱中保存。

组织匀浆：取出冻存的脑皮层和海马组织0.1 g放入1 mL的生理盐水中,制备10%的组织匀浆。

1.2.3 组织蛋白质含量测定

取10%组织匀浆液于适宜的考马斯亮蓝中，混匀。放置两分钟，然后取200 μL于96孔板中，用酶标仪测出各个待测样的吸光度值，保证所得到的吸光度值在标准曲线中良好的线性范围之内。

1.2.4 NOS活力

NOS的测定原理是：NOS催化L-Arg和分子氧反应生成NO,NO与亲核性物质生成有色化合物，在530 nm波长下测定吸光度，根据吸光度的大小可计算出NOS活力。当被测样品中含有NOS时，产生NO与过氧化物一起导致过氧化，引起组织损伤，比色时测定管的吸光度值高于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中的NOS活力。

计算公式：

具体的操作步骤：混匀，530 nm处，1 cm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度值。

1.2.5 制作标准蛋白曲线

采用考马斯亮蓝法[12-14]。

1.2.6 SOD酶活性的测定

按SOD活力的测定试剂盒操作，每毫克组织蛋白在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位(U)。

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计算公式为：

1.2.7 MDA含量的测定

采用TBA法，酶标仪在532 nm处可以测定出样品的吸光光度值，通过公式即可求算出被测样品中MDA的含量。

计算公式为：

组织中MDA含量计算公式：

1.3 统计方法

数据表示为均值 ± 标准差(Mean ± S.D.)。数据采用Student’s-t检验进行组间比较，p小于0.05认为有统计学意义。

2 试验结果

2.1 NOS活性

NOS是NO合成过程中起关键作用的酶，NOS在静息状态的细胞内是不表达的，但当细胞受到细胞因子和免疫微生物等刺激时，如脂多糖(LPS)的强烈诱导，NOS催化合成非生理浓度的大量NO，产生一系列的病理作用。本试验中,小鼠脑皮层和海马组织中NOS的活性如图1所示。

图1 白藜芦醇预防后检测小鼠脑皮层内NOS活性 *LPS组与CON组相比有显著性差异(p<0.05)#Res+LPS组与LPS组相比有显著性差异(p<0.05)

2.1.1 白藜芦醇预防后对小鼠脑皮层中NOS活性的影响

从图1可知，LPS处理后小鼠脑皮层中的NOS活性显著提高，表明氧化损伤诱导模型建立成功；用白藜芦醇预防10天后脑海马中NOS活力水平较模型组有所降低，表明白藜芦醇可清除小鼠脑皮层中的自由基，对NOS表达及NO合成过程有抑制作用，且有显著性差异。

2.1.2 白藜芦醇预防后小鼠脑海马中NOS活性的影响

从图2中可以看出，用LPS处理后小鼠脑海马中的NOS活性显著提高，表明氧化损伤诱导模型建立成功；用白藜芦醇预防10天后脑海马中NOS活力水平较模型组有所降低，表明白藜芦醇可清除小鼠海马中的自由基，对NOS表达及NO合成过程有抑制作用，且有显著性差异。

图2 白藜芦醇预防后检测小鼠海马内NOS活性*LPS组与CON组相比有显著性差异(p<0.05)#Res+LPS组与LPS组相比有显著性差异(p<0.05)

2.2 SOD酶活性

图3 白藜芦醇预防后检测小鼠脑皮层内SOD活性*LPS组与CON组相比有显著性差异(p<0.05)

SOD是线粒体内含量较为丰富的一种抗氧化物酶。它可以清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤。小鼠脑皮层、海马组织中SOD的活力如图3和图4所示。模型组小鼠与对照组相比脑皮层中的SOD活力明显降低。海马内预防组与模型组相比能显著升高SOD活性(p< 0.05)，由此说明白藜芦醇预防后可显著提高预防组小鼠脑海马中的SOD活力。

图4 白藜芦醇预防后检测小鼠海马内SOD活性#Res+LPS组与LPS组相比有显著性差异(p<0.05)

2.3 MDA含量

MDA是多不饱和脂肪酸过氧化物的降解产物。脂质过氧化物是由氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸形成的，小鼠脑皮层和海马中MDA含量如图5和图6所示。预防组小鼠和模型组小鼠相比，脑皮层和海马中MDA的含量明显降低，由此说明，应用白藜芦醇预防后可显著降低预防组小鼠脑皮层和海马中MDA的含量，具有统计学意义。

图5 白藜芦醇预防后检测小鼠脑皮层内MDA含量*LPS组与CON组相比有显著性差异(p<0.05)##Res+LPS组与LPS组相比有显著性差异(p<0.01)

图6 白藜芦醇预防后检测小鼠海马内MDA含量*LPS组与CON组相比有显著性差异(p<0.05)

3 结 语

相关文献表明，白藜芦醇是源自天然植物中的脂溶性抗毒素，属于多酚类化合物，主要存在于虎杖、葡萄和花生等自然植物中。其在人体内的重要作用有抗氧化、抗炎和抗衰老等作用[6]。

本文试验结果显示，模型组小鼠脑皮层和海马中内源性抗氧化酶SOD活性下降，说明脑皮层和海马遭受氧化损伤，白藜芦醇可提高SOD活性，减轻了LPS介导的脑皮层和海马的氧化损伤。

本试验中，模型组注射10天LPS后，脑皮层和海马中MDA含量明显上升，与模型组相比，预防组小鼠脑皮层和海马中MDA的含量明显降低。试验结果说明小鼠脑皮层、海马氧化损伤得到控制，白藜芦醇使自由基的生成受到抑制，减轻了LPS诱导的脑皮层、海马的氧化损伤。笔者认为，藜芦醇能够预防LPS引起的脑皮层和海马组织的氧化损伤，这可能是由于白藜芦醇可以减少或抑制氧自由基的生成，从而降低过氧化对机体造成的损伤。

本次试验结果表明：模型组LPS处理过的小鼠脑皮层和海马组织中的NOS活性显著提高，用白藜芦醇预防10天后脑海马中NOS活力水平较模型组有所降低，但与空白对照组相比未见明显差异。这表明白藜芦醇可清除小鼠脑皮层和海马中的自由基，对NOS表达及NO合成过程有抑制作用，但无显著性差异。