白杨素对脑缺血-再灌注损伤的神经保护机制研究＊

王叶叶，江 羽，梁 晨，石 峥，谭 睿,2＊＊

（1.西南交通大学医学院 成都 610031；2.西南交通大学生命科学与工程学院 成都 610031）

脑缺血是严重的脑血管疾病，由于颅内血管阻塞引起脑血流异常，导致局灶性脑组织损伤、神经功能失常。脑缺血在临床脑血管疾病中最为常见，约占80%[1]，该病发病率高、致残率高、死亡率高，使患病者生活自理能力降低，严重危害人类健康和生活[2]。脑缺血发病后发生缺血级联反应，梗死区域因缺血出现氧化应激和兴奋性毒性，破坏水电离子平衡，造成梗死灶神经元死亡，接着神经炎症激活，慢性炎症会导致脑水肿和半暗带区神经元死亡，从而影响神经功能恢复[3]。脑缺血过程中一个重要特点是神经元大量且快速凋亡，再灌注后很长一段时间内神经元仍然持续凋亡。目前处于临床研究阶段的药物主要包括溶栓药、神经保护剂两类。但溶栓药安全性低、治疗时间窗窄，神经保护剂绝大多数临床疗效较差，促进脑缺血后神经元再生等缺血后神经功能恢复的研究受到广泛关注，包括干细胞、神经营养因子、小分子药物等[4]，其中，神经营养因子能促进突触和轴突重塑及再生，促使神经功能再生[5]，补充神经生长因子（NGF）对于保护神经元具有重要意义[6]。NGF 能促进轴突定向再生[7]，使之与靶细胞形成功能连接，最终修复受损神经细胞，达到改善神经功能缺损症状的目的。但是NGF 难以在脑组织中维持理想浓度，直接给予NGF难以发挥稳定的生物学效应。目前已有人提出重组细胞注入法，置管脑外注药法，神经通路给药法等[8-9]新的给药方式给药，以期NGF达到更稳定的效应。

白杨素（Chrysin）为5,7-二羟基黄酮，是中药材益智仁的主要黄酮类成分之一，曾从紫葳科植物木蝴蝶中提取得到，是一种具有抗肿瘤、抗焦虑、抗炎、抗氧化等药理活性的黄酮类化合物[10]，它可以通过上调Nrf2-ARE 信号通路相关蛋白而激活大鼠体内抗氧化酶系和自由基清除系来减轻这些物质对大鼠脑组织造成的损伤，对脑缺血有治疗作用[11]。另外，白杨素也可能通过上调p-ERK、同时下调NF-κB和p-P38的表达发挥神经保护的作用[12]。然而，对于白杨素对脑缺血再灌注损伤中如何修复受损神经元方面无报道。

本实验通过建立的NGF 神经营养因子药物筛选模型，发现白杨素具有潜在的脑缺血后神经保护作用，在体外实验中，用白杨素诱导MSC，检测出MSC 细胞表面多种神经标志性蛋白。而后在体内实验中，用不同剂量白杨素对脑缺血再灌注大鼠治疗，脑梗死、含水量均一定程度降低，且大鼠脑组织NGF、BDNF蛋白也较对照组明显增加，进而显示出白杨素通过上调NGF、BDNF蛋白表达发挥脑缺血后神经保护作用。

1 材料与方法

1.1 细胞、药物和试剂

大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞（PC12 细胞，中国科学院上海细胞所）；MSC 细胞（自提，来源于3-4 周龄SD 大鼠骨髓间充质）；高糖DMEM 培养基(Hyclone，J180003)，L-谷氨酸溶液(Glu，LEAGENE，0404A18)；四甲基偶氮唑盐（MTT 粉末，锐赛生物公司，180315）；DAPI（谷歌生物有限公司，20180326）；FITC 标记山羊抗小鼠IgG（H+L）（碧云天生物技术公司，A0562）；NGF一抗（谷歌生物，GB11143）；BDNF 一抗（谷歌生物，GB11240）；荧光二抗CY3 山羊抗兔（谷歌生物，GB-21303）；GalC 一抗（Solarbio，K003717P）；Nestin 一抗（碧云天生物技术公司，AF2215）；NSE一抗（碧云天生物技术公司，AF2164）；Vimentin 一抗（Abbkine，ABP-52697）；2，3，5—氯化三苯基四氮唑（TTC）（源叶生物科技有限公司，BCBR5460V）；4%多聚甲醛（Biosharp，180119）；苏木素染液套装（武汉谷歌生物科技有限公司，G1005）

1.2 实验动物

60 只6-8 周龄SD 雄性大鼠，清洁级，体质量约280-300 g，由成都达硕实验动物有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 PC12细胞培养及细胞存活率检测

PC12 细胞接种于含有10%胎牛血清，105 U/L 青链霉素的DMEM 高糖培养基中，在37℃含5%CO2的细胞孵箱中培养，取对数生长期的PC12 细胞按照2×104个/孔接种于96 孔板中，设置空白组、对照组、谷氨酸损伤组和白杨素给药组。给药组24 h 后加入5、10、20、30、50 μM浓度的Chrysin。继续孵育24 h后各组加入10 mMGlu溶液诱导24 h，对照组不做处理。每孔加入20 μL终浓度为5 mg·mL-1的MTT溶液，培养2-4 h，弃去上清，加入150 μL DMSO振荡10 min后于570 nm波长处用酶标仪测取OD值，计算细胞存活率[13]。

1.3.2 白杨素诱导MSC后蛋白含量测定

以NGF 为靶点，利用NGF 的启动子连接Luc 荧光素酶报告基因，构建质粒模型，并转染进入HEK-293细胞，建立可用于筛选具有促NGF分泌作用的人胚肾上皮细胞药物筛选模型。通过此模型筛选出中药单体白杨素具有潜在神经保护作用，并进一步检测了白杨素诱导后1、3、5、7 天的MSC 细胞表面神经标志物NGF、GalC、Nestin、NSE、Vimentin的表达量。

取3-4周龄SD大鼠，无菌环境下取其骨髓间充质干细胞，DMEM 低糖培养基中培养。适宜密度的MSC接种于六孔板中，1 μM 白杨素预处理24 h 后，加入山羊血清室温封闭30 min 后吸除，滴加一抗，4℃孵育过夜，加FITC 标记的二抗室温孵育1 h，复染核后封片，观察、采集图像。

1.3.3 白杨素诱导MSC 对大鼠脑缺血再灌注的脑神经保护作用

（1）实验动物分组与给药

在实验室中进行5-7天适应性饲养，自由饮水，正常饮食。术前12 h禁食，自由饮水。实验前随机分组，将SPF级SD雄性大鼠随机分成5组：假手术组（Sham），模型组（Model），白杨素（Chrysin）高、中、低剂量治疗组，每组动物12 只。治疗组大鼠均灌胃给药，高、中、低剂量治疗组剂量分别为20 mg·kg-1，10 mg·kg-1，5 mg·kg-1。造模24 h 前给药预保护一次，造模成功后再连续给药3天。给药总体积为10 mL·kg-1。

（2）脑缺血再灌注损伤模型的制备

各组大鼠均在灌胃给药预保护1 天后，禁食不禁水12 h，进行手术，参照Longa 等[14]的方法制备MCAO模型，腹腔麻醉大鼠，在颈部中间切开，钝性分离肌肉，暴露并分离右侧颈总动脉（CCA），颈外动脉（ECA），颈内动脉（ICA），近心端结扎CCA，动脉夹夹闭ICA，在CCA上开一小口，从CCA插入线栓，顺着ICA入颅至中动脉，用缝合线缝合伤口，缺血2h 后进行再灌注。假手术组除不插入线拴外其余步骤同上。

图1 不同浓度白杨素作用下PC12谷氨酸损伤细胞的存活率

1.4 观察指标

1.4.1 MCAO损伤大鼠神经行为学评分

根据Zea Longa 五分制法[15]对大鼠进行神经功能（modified Neurological Severity Scores，mNSS）评分。在缺血再灌注后2 h、1天、2天、3天分别评分。

1.4.2 大脑梗死体积比的测定

股动脉取血后立即取脑，去除嗅球和小脑，沿冠状面切成厚度为2 mm的脑片，共5片。放在20 mL的2%TTC 磷酸盐缓冲液（pH7.6）中，避光，在37 度水浴30 min，染色后，用4%多聚甲醛固定，拍照，计算梗死体积，计算梗死体积比[16]。

1.4.3 脑组织含水量测定

缺血2 h 后再灌注5 天，断头处死大鼠，将脑完整取出，除去小脑、低位脑干以及嗅球。用生理盐水洗净，滤纸吸干，称量脑湿重，然后再将脑组织进行烘干(105℃，24 h)后称重，按干湿重法计算脑组织含水量。计算公式：脑组织含水量（%）=（脑湿重-脑干重）/脑湿重×100%[17]。

1.4.4 脑组织缺血半暗区组织学改变和海马CA1 区NGF，BDNF蛋白表达

取脑组织，4%多聚甲醛固定，HE 染色，显微镜观察缺血半暗区的变化；免疫荧光染色观察海马CA1区NGF，BDNF蛋白的表达。

1.5 统计学方法

运用Graphpad Prism7 和SPSS18.0 软件进行统计学分析，数据结果以均数±标准差(xˉ±s)表示。多组数据之间的比较使用单因素方差分析分析结果。P ＜0.05被认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 PC12细胞存活率

细胞存活率实验（图1），与谷氨酸损伤对照组相比，在5、10、20、30 和50 μM 的白杨素药物浓度作用下，白杨素干预组细胞存活率均有上升，其中5、10 μM的白杨素作用下细胞存活率上升显著（P ＜0.01），20、30 μM的白杨素作用下细胞存活率上升明显（P ＜0.05）（图1）。对正常PC12 细胞没有毒性且在谷氨酸（10 mM）诱导下又对细胞起保护作用的白杨素药物浓度为10 μM。

2.2 白杨素诱导MSC后蛋白含量测定

MSC 细胞表面神经标志物NGF、GalC、Nestin、NSE、Vimentin均有表达（图2），3天时NSE表达突出，5天时NGF、Nestin、Vimentin 表达较多。经白杨素诱导后，MSC细胞神经营养因子蛋白表达增加。

2.3 大鼠神经行为学评分，脑梗死体积及含水量

结果表明（表1），与模型组比较，假手术组大鼠的神经行为学评分为0，给药组大鼠神经功能评分均具有不同程度的减小，10 mg·kg-1和20 mg·kg-1剂量白杨素给药后2天和3天缺血大鼠神经行为学评分显著降低（P ＜0.05），差异均具有统计学意义。

与假手术组比较，模型组大鼠脑梗死明显（图3a,b），模型组脑含水量显著增加（P ＜0.05）（图3c）。与模型组相比，Chrysin给药组脑梗死体积均减少，10 mg·kg-1和20 mg·kg-1剂量Chrysin组梗死体积比与模型组有显著差异（P ＜0.05）（图3b），且随剂量增加，梗死体积逐渐减小。与模型组相比，给药组脑含水量均有一定降低，但没有显著性差异（P ＞0.05）（图3c），提示白杨素可一定程度减轻神经功能损伤症状。

2.4 大鼠脑缺血半暗区组织学染色及海马CA1 区NGF、BDNF蛋白荧光染色

大鼠脑缺血半暗区组织学染色显示（图4），假手术组神经元排列整齐紧密，层次清楚，核膜完整，核仁清晰可见；模型组出现细胞间隙变宽，细胞形态极不规则，深染，核固缩，溶解等细胞坏死特征。与模型组相比，给药组大鼠神经细胞病变较轻，且Chrysin-20 mg·kg-1组细胞间联系紧密，空泡状减少，治疗效果显著。

免疫荧光染色法对脑组织NGF、BDNF 蛋白进行染色（图5），与假手术组相比，模型组大鼠脑海马CA1区NGF、BDNF蛋白荧光强度降低，提示其表达量显著降低（P ＜0.05）；与模型组相比，给药组大鼠脑海马CA1区NGF、BDNF蛋白红色荧光表达有明显增加，且随着给药剂量增加，荧光强度增大，说明在缺血再灌注损伤后，给Chrysin大鼠脑海马CA1区NGF、BDNF有一定程度增加，这对受损神经细胞有一定的修复作用。

图2 杨素诱导MSC后不同时间细胞表面神经营养因子NGF、GalC、Nestin、NSE、Vimentin的免疫荧光表达（a）×400及表达量（b）

图3 大鼠脑部TTC染色（a；白色区域代表梗死部位；红色区域为正常部位）；脑梗死体积（%）（b；￥P ＜0.05：与模型组相比）；脑含水量（%）（c；¢P ＜0.05：与假手术组相比）

表1 各组不同时间神经行为学评分（xˉ±s,n=12）

3 讨论

据报道，神经保护治疗能恢复神经功能[18]，神经元的存活及维持正常功能依赖于神经营养因子[19]，由于神经营养因子多为大分子肽，难以通过血脑屏障，外周给药难以到达作用部位，充分诱导内源性神经营养因子的表达可能是治疗缺血-再灌注神经元损伤的重要途径[20]，而BDNF 和NGF 是神经营养因子家族中的重要成员，并且脑缺血后脑神经细胞受损程度与BDNF和NGF的表达含量密切相关[20,21]。

图4 大鼠脑缺血半暗区HE染色×100

图5 大鼠脑海马CA1区NGF蛋白（a）、BDNF蛋白（b）荧光染色×100（蓝色：DAPI，红色：目标蛋白）

本实验通过药物筛选模型，发现白杨素具有潜在神经保护作用，将白杨素诱导MSC细胞后检测MSC细胞神经标志性蛋白，得到NGF、GalC、Nestin、NSE、Vimentin 五种神经标志蛋白的较好表达，说明了白杨素可以诱导MSC 细胞向神经样细胞分化。在此基础上进行体内验证，通过建立脑缺血-再灌注动物模型考察了不同剂量给药组神经功能评分、脑梗死体积、脑含水量的变化，结果显示白杨素具有减轻缺血-再灌注损伤中神经损伤的作用，同时对各组脑缺血半暗带进行组织学染色，观察到给药后组织空泡减少，联系紧密，病变减轻。此外，给药后，损伤部位的NGF、BDNF神经营养因子表达上调也表明白杨素对受损神经细胞有修复作用。实验结果证实了上调内源性的干细胞表达NGF、BDNF 营养因子是白杨素治疗脑缺血再灌注损伤的重要机制。

综上所述，白杨素通过上调脑缺血-再灌注损伤中NGF和BDNF蛋白表达，减轻神经损伤症状，发挥治疗神经元损伤的作用。这为缺血性脑损伤的治疗提供了新的思路，具有潜在的临床应用价值。