基于钌配合物作荧光探针测定半胱氨酸的新型DNA荧光传感器

肖志友，司恒丹，王建文，张 鑫，肖茹峄，刘益飞

(贵州理工学院 化学工程学院，贵州 贵阳 550003)

半胱氨酸(Cysteine)是人体内不可缺少的一种含巯基氨基酸，它在人体中许多重要的细胞功能如蛋白质合成、解毒、新陈代谢等方面起着非常重要的作用[1-2]。半胱氨酸的缺乏可能会导致许多症状，如儿童生长缓慢、头发褪色、肝脏损害、嗜睡等[3]。然而，过高的半胱氨酸水平也可能会引起心血管疾病、阿尔茨海默病、骨质疏松症和妊娠胎儿神经管缺陷等[1,3-4]。因此建立简单、灵敏测定半胱氨酸的传感器具有重要意义。

DPPZ(dipyridophenazine)类金属钌(Ⅱ)配合物，如Ru(phen)2(dppz)2+,Ru(phen)2(dppx)2+,Ru(bipy)2(dppz)2+和Ru(bipy)2(dppx)2+(其中phen= 1,10-phenanthroline; dppz= dipyridophenazine; dppx= 7,8-dimethyldipyrido phenazine; bipy= 2,2-bipyridine)等，在水溶液中荧光被猝灭；当溶液中含有双链DNA时，由于配体DPPZ插入碱基对中，疏水环境阻碍水分子对其荧光淬灭，荧光发射强度增加达104倍,具有良好的核酸分子“光开关”效应[5-7]。利用钌配合物这一特性，该荧光探针广泛应用于金属离子测定[5,8]，DNA单碱基错配识别[9]，金纳米粒子修饰DNA密度探测[10]等。我们在前面的研究中，利用钌配合物具有核酸分子“光开关”特性和Ag+稳定含C- C错配碱基的双链DNA建立了测定银离子的DNA荧光传感器[5]。

最近有很多研究报道利用半胱氨酸能与银离子发生强烈相互作用构筑了测定半胱氨酸的传感器[2,11-13]，这些传感器虽然具有较好的灵敏度和选择性，但很多需要对DNA末端进行荧光基团修饰，或需要利用其他纳米粒子作为辅助传感平台。这里我们拟在前面基于钌配合物测定银离子传感器的基础上，利用半胱氨酸与银离子相互作用诱导银离子稳定的双链DNA解链为单链DNA，被双链DNA保护的钌配合物荧光发生淬灭，建立一种测定半胱氨酸的新型DNA荧光传感器。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

岛津RF-5301PC型荧光分光光度计(日本岛津公司)，北京普析TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)， pHS-3C pH计(上海雷磁仪器厂)，DC-1020低温恒温槽(宁波赛福实验仪器有限公司)。

L-半胱氨酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硝酸钠、硝酸银(上海国药集团化学试剂有限公司)，所有试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。含错配胞嘧啶碱基C的寡聚脱氧核苷酸序列(Probe-1，5'-TAC ATA CTA TAC TAT CTA-3')购自上海生工生物工程有限公司。实验所用核酸分子“光开关”试剂Ru(phen)2(dppx)(BF4)2·2H2O按照参考文献合成[14](该钌配合物中phen为1,10-菲罗啉；dppx为7,8二甲基-吡啶并[3，2-a：2',3'-c]吩嗪)。

1.2 实验方案

实验方案如图1所示，没有半胱氨酸(Cysteine)存在时，含C-C错配碱基对的自互补单链DNA(Probe-1)通过Ag+稳定形成双链DNA，钌配合物荧光探针Ru(phen)2(dppx)2+的荧光受到双链DNA的保护，荧光发射较强；当溶液中有半胱氨酸存在时，其与银离子发生强烈相互作用，失去银子辅助稳定的双链DNA解链为单链DNA，钌配合物Ru(phen)2(dppx)2+的荧光得不到保护而明显减弱，据此建立测定半胱氨酸的DNA荧光传感器。

图1 基于钌配合物荧光探针测定半胱氨酸DNA荧光传感器的原理示意图

Fig.1 Schematic diagram of DNA fluorescence sensor for the determination of cysteine based on Ruthenium complex as fluorescence probe

1.3 荧光发射光谱的测定

往500 μL含2.0 μmol/L Ru(phen)2(dppx)2+、120.0 mmol/L NaNO3、150.0 nmol/L Probe-1的20 mmol/L PBS(pH值 7.5)缓冲溶液塑料离心管中，加入200.0 nmol/L Ag+保留2 h。所得溶液加入不同浓度的半胱氨酸，再保留40 min，于RF-5301PC型荧光分光光度计上测定混合溶液的荧光发射光谱。荧光光谱仪的扫描参数设置：激发波长为460 nm，发射波长扫描范围为500 ～700 nm，激发和发射狭缝宽度均设置为5 nm。

1.4 解链曲线的测定

将两支含3.0 μmol/L Probe-1、 9.0 μmol/L Ag+和120.0 mmol/L NaNO3的20 mmol/L PBS(pH值7.5)缓冲溶液的离心管，在水浴中加热至93℃，该温度下保持5 min，然后缓慢冷却至室温。往其中一支离心管中加入9.0 μmol/L半胱氨酸，反应半小时后，将两支离心管于4℃冰箱上层冷藏待用。取上述两支离心管溶液加入微量石英比色皿中(比色皿厚度为1 cm)，通过紫外可见分光光度计测量不同温度时加与不加半胱氨酸溶液在λ= 260 nm处的吸光度值，测量温度范围为10～60℃，每升温2℃(恒温5 min)记录1次吸光度值。

2 结果与讨论

2.1 实验可行性分析

为了检验该方法的可行性，我们对含银离子、Probe-1和荧光探针Ru(phen)2(dppx)2+的混合溶液加半胱氨酸前后的荧光光谱进行对比分析。如图2所示，不含半胱氨酸溶液的荧光发射强度较大(图2a)，因为Ru(phen)2(dppx)2+插入到银离子稳定的自互补双链DNA中，荧光得到保护而较强；当加入400.0 nmol/L半胱氨酸后，混合溶液的荧光发射强度(图2b)明显低于未加之前的荧光强度。实验结果表明该方法可用于半胱氨酸的测定。

为进一步探讨半胱氨酸的加入导致荧光强度降低的机理，我们采用紫外可见分光光度计测定加半胱氨酸前后Probe-1的解链曲线。如图3所示，加半胱氨酸之前含银离子Probe-1能看到约25℃的解链温度(图3a)，说明Probe-1通过银离子的稳定作用形成了双螺旋结构；而相同实验条件下，加入半胱氨酸后，解链曲线(图3b)上看不到明显的解链温度，说明加入半胱氨酸与银离子发生作用后，Probe-1不再形成双链DNA结构。该结果与上述荧光强度变化相吻合。

图2 加半胱氨酸前(a)和后(b)含银离子、Probe-1和 Ru(phen)2(dppx)2+混合溶液的荧光光谱Fig.2 Fluorescence spectra of the solutions containing Ag+, Probe-1 and Ru(phen)2(dppx)2+ in the absence(a) and presence (b) of 400 nmol/L cysteine

图3 加(b)与不加(a)半胱氨酸Probe-1的解链曲线Fig.3 Melting curves of the solution containing 9.0 μmol/L Ag+and 3.0 μmol/L Probe-1 in the presence (b) and absence (a) of 9.0 μmol/L cysteine

2.2 线性范围与选择性

我们在前面测定银离子传感器[5]有关实验条件基础上，记录加入不同浓度半胱氨酸时混合溶液的荧光发射光谱。如图4所示，溶液的荧光强度随着半胱氨酸浓度的增加而降低，半胱氨酸浓度与溶液在610 nm处荧光强度在0.0 ～160.0 nmol/L范围内呈良好的线性关系，线性方程为：If= - 0.122 c + 57.09，相关系数(r)为0.9928，检出限(3δ/S)为13.8 nmol/L。

图4 存在不同浓度半胱氨酸溶液的荧光光谱(A)和线性关系图(B)

Fig.4 Fluorescence spectra (A) and linear diagram (B) of the solutions containing Ag+,Probe-1 and Ru(phen)2(dppx)2+

in the presence of different concentration of Cysteine (a-j): 0.0,20.0,40.0,80.0,120.0,160.0,200.0,300.0,400.0 nmol/L

为了检验该方法的选择性，我们对160.0 nmol/L半胱氨酸(Cysteine，Cys)和1600.0 nmol/L 8种其他氨基酸 { L-异亮氨酸(Isoleucine,Ile)、组氨酸(Histidine,His)、L-赖氨酸(Lysine,Lys)、甘氨酸(Glycine,Gly)、L-胱氨酸(L-Cystine,Cysti)、L-丙氨酸(L-Alanine,Ala)、L-丝氨酸(L-Serine,Ser)、亮氨酸(Leucine,Leu)}进行对比分析，考察加氨基酸前后溶液的荧光强度改变值(ΔI)。如图5所示，加半胱氨酸前后溶液的荧光变化值ΔI远大于10倍其浓度的其他氨基酸，说明该方法用于半胱氨酸测定具有较好的选择性，其他氨基酸对其测定不会有干扰。

图5 方法的选择性Fig. 5 Selectivity of the assay

3 结论

本文以钌配合物Ru(phen)2(dppx)2+作为荧光探针，以银离子稳定的含错配胞嘧啶碱基的自互补DNA序列(Probe-1，5'-TAC ATA CTA TAC TAT CTA-3')作为传感元件，当溶液中没有半胱氨酸，荧光探针Ru(phen)2(dppx)2+插入银离子稳定的双链DNA中，其荧光得到保护而有较强的荧光发射；当溶液中有半胱氨酸存在时，其与银离子发生强烈相互作用，导致银离子稳定的双链DNA解链为单链DNA，失去保护的Ru(phen)2(dppx)2+荧光强度明显减弱。基于这一原理，我们建立了一种测定半胱氨酸的新型DNA荧光传感器。在上述实验条件下，溶液在610 nm处的荧光强度与半胱氨酸的浓度在0.0 ～160.0 nmol/L范围内呈良好的线性关系，线性方程为：If= - 0.122 c + 57.09，相关系数(r)为0.9928，检出限(3δ/S)为13.8 nmol/L。该方法仅需要一条DNA序列，无需对DNA进行荧光基团的修饰，方法操作简单灵敏，具有较好的选择性。