基于TGF-β1/Smad3通路探讨脾胃培源方对慢性萎缩性胃炎大鼠干预作用

2019-09-10 07:22李玉凤陈亮亮李学军
湖南中医药大学学报 2019年2期
关键词:萎缩性幽门胃炎

李玉凤 陈亮亮 李学军

〔摘要〕 目的 观察脾胃培源方对慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)大鼠血清胃蛋白酶原I(pepsinogenI, PGⅠ)、胃蛋白酶原Ⅱ(pepsinogenⅡ, PGⅡ)、胃泌素(gastrin-17, G-17)水平的影響,通过研究转化生长因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)和Smad3蛋白在CAG大鼠胃组织中的表达,探讨TGF-β1/Smad3信号传导通路在CAG发病过程中的作用以及脾胃培源方的治疗机制。方法 选用SPF 级Wistar雄性大鼠100只,随机分为:空白对照组、模型组、维酶素组、脾胃培源方(高、中、低剂量)组,采用幽门弹簧植入术配合高盐热淀粉糊灌胃法制备CAG大鼠模型。造模成功后,各组予以相关干预,连续灌胃4周,4周后处死大鼠取血清及胃组织。通过HE染色观察大鼠胃组织病理学的改变,并采用Elisa法和Western blot法检测血清PGⅠ、PGⅡ、G-17水平及TGF-β1、Smad3蛋白表达。结果 与空白对照组比较,模型组血清PGⅠ、G-17水平及Smad3蛋白表达显著降低(P<0.05),TGF-β1蛋白表达明显上升(P<0.05);与模型组比较,脾胃培源方组和维酶素组血清PGⅠ、G-17水平及Smad3蛋白表达明显上升(P<0.05),TGF-β1蛋白表达明显降低(P<0.05),血清PGⅡ均未见明显变化,差异无统计学意义(P>0.05);维酶素组和脾胃培源方(高、中、低剂量组)4组间采取两两比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 脾胃培源方能明显改善CAG大鼠的胃组织损伤,下调胃组织TGF-β1蛋白表达及上调Smad3蛋白的表达,说明TGF-β1/Smad3信号转导通路参与了CAG发病过程,脾胃培源方治疗CAG可能通过干预该通路的表达而实现。

〔关键词〕 慢性萎缩性胃炎;胃蛋白酶原;转化生长因子β1;Smad3;脾胃培源方

〔中图分类号〕R285.5;R573.3+2       〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi:10.3969/j.issn.1674-070X.2019.02.006

慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)是慢性胃炎的一种类型,呈局限性或广泛性的胃黏膜固有腺体萎缩(数量减少、功能减低),常伴有肠上皮化生及异型增生[1],属临床常见病、多发病、疑难病,尤以脾胃虚弱型为常见,主要症状表现有上腹部胀满、疼痛,烧心及消化不良症状等[2]。慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生和异性增生与胃癌的发生关系密切,尤其肠上皮化生被认为是萎缩的典型标志及胃癌的前兆[3]。现代医学对于CAG缺乏有效的治疗手段。脾胃培源方是首届全国名老中医马骏教授治疗CAG的有效经验方。研究证实[4],转化生长因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)/Smad3信号通路与 CAG密切相关,通过调节此通路可以抑制异型增生细胞的增殖,促进胃萎缩黏膜的修复,从而达到治疗 CAG的目的。因此,本实验研究旨在探讨TGF-β1/Smad3信号通路在CAG发病中的作用,以及分析探讨脾胃培源方治疗CAG的分子生物学机制,为脾胃培源方临床治疗CAG提供实验依据。

1 材料

1.1  动物

选用SPF级Wistar雄性大鼠100只,体质量(200±20)g,鼠龄5~7周,由南京医科大学实验动物中心提供,许可证号:SCXK(苏)2016-0002,保持室温、自然光照周期,适应性喂养1周。

1.2  药品及主要仪器

脾胃培源方药物组方中各味饮片购自安徽中医药大学第二附属医院中草药房;维酶素片:广西大海阳光药业有限公司,0.2 g/片。352型酶标仪(芬兰Labsystems公司);JW3021HR型离心机(安徽嘉文公司);

LGJ-10 多歧管压盖型冷冻干燥机(北京松源有限公司);DMI-6000B型倒置荧光显微镜(德国莱卡公司);垂直电泳装置(美国Bio-Rad公司);ELISA 试剂盒(上海源叶生物技术有限公司);兔抗鼠TGF-β1单克隆抗体(Bioworld公司);山羊抗鼠磷酸化Smad2/3多克隆抗体(美国Santa Cruz公司);辣根过氧化物酶标记IgG二抗(美国KPL公司)。

2 方法

2.1  动物分组与模型建立

健康雄性SPF级Wistar雄性大鼠100只,随机分为:空白对照组、模型组、维酶素组、脾胃培源方(高、中、低剂量组:简称为高剂量组、中剂量组、低剂量组)组,每组15只,其中,选取空白对照、假手术组、模型组大鼠各3只,用来验证CAG脾胃虚弱证模型是否复制成功。采用幽门弹簧植入术配合高盐热淀粉糊灌胃法制备CAG大鼠模型[5]:(1)制备幽门弹簧:将金属环型宫内节育器中硅橡胶和铜丝去掉,拉直,并剪成小段弹簧,将两边断端弯入弹簧内;(2)弹簧幽门植入术:腹腔麻醉后,在无菌条件下开腹,暴露胃,在胃前壁距幽门环0.2 cm处切一小口,金属弹簧前 1/3 插过其幽门环进入十二指肠,用缝线将弹簧两端及中央固定,按手术常规缝合;(3)药物造模方法:术后第2周开始药物造模,给予高盐热淀粉糊(含15%氯化钠,25%可溶性淀粉,60~70 ℃)灌胃,每只2 mL/d,每周2次(周二、周五),连续10周。

2.2  药物干预及标本采集

造模成功后,空白对照组和模型组予3 mL生理盐水灌胃;维酶素组予维酶素悬浊液3 mL/d灌胃;脾胃培源方(高、中、低剂量组)予3 mL/d灌胃,分别按相当于人临床等效剂量的2倍、4倍、8倍×人与大鼠药物剂量换算系数6.71倍,以成人体质量 60 kg计算,分别予20、10、5 g/kg ,连续灌胃4周。4周后禁食不禁水24 h经腹主动脉采血,分离血清后,置于-20 ℃低温冰箱待检测。采血后,处死大鼠,取幽门与前胃及腺胃交界线连线的2/5部分,其一,取一部分组织标本,浸入甲醛中固定,石蜡包埋、切片后行HE染色;其二,剩余一部分标本放入液氮冰冻保存用于Western blot检测。

2.3  组织病理学检测

取大鼠胃标本置于4%甲醛溶液中固定,常规脱水、石蜡包埋、切片,行HE染色,观察大鼠胃黏膜组织病理学改变。

2.4  ELISA法檢测大鼠血清胃蛋白酶原I(pepsinogenI, PGⅠ)、胃蛋白酶原Ⅱ(pepsinogenⅡ, PGⅡ)、胃泌素(gastrin-17, G-17)水平变化

冰箱取出经腹主动脉采血分离后的大鼠血清PGⅠ、PGⅡ、G-17试剂盒及大鼠血清,具体操作按试剂盒要求操作,放入酶标仪在10 min内中用双波长即检测波长450 nm和校正波长620 nm同时读板,采集实验数据,制作标准曲线,计算各样本实际浓度。

2.5  Western Blot法检测胃组织标本中TGF-β1、Smad3蛋白的表达

提取胃黏膜组织蛋白,蛋白浓度由BCA法检测,在收集的蛋白样品中加入蛋白上样缓冲液,混匀,100 ℃加热7 min使蛋白质变性。按顺序加入蛋白样品,经SDS-PAGE电泳后,电转膜至PVDF 膜,室温封闭2 h,TBST 洗涤3次,10 min/次,分别加入1∶500兔抗鼠TGF-β1、Smad3一抗,4 ℃摇床过夜,加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗(1∶2 000),置室温作用2 h,TBST 洗涤 3 次,每次10 min,滴入Super Signal West Femto高灵敏度化学发光底物显影1 min,采用凝胶图像处理系统进行吸光度扫描,将TGF-β1、Smad3蛋白条带的吸光度与β-actin比值作为其蛋白的表达值。

2.6  统计学方法

采用SPSS 23.0统计软件进行统计学分析,计量资料采用“x±s”表示。实验结果多组间均数比较采用单因素方差分析,两组间均数比较采用LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1  胃组织病理学改变

空白对照组大鼠胃黏膜结构完整,胃黏膜表面正常,细胞排列整齐,黏膜层未见炎性细胞和红细胞;模型组大鼠胃黏膜表面相对明显缺损,黏膜层变薄,腺体数目明显减少,排列较紊乱,黏膜下小血管清晰可见,细胞核固缩且深染,核浆比例失调;脾胃培源方组和维酶素组胃黏膜结构较完整,但4组间胃黏膜组织腺体萎缩不明显,与模型组相比可见炎性细胞数目较少,无细胞核固缩。

3.2  大鼠血清PGⅠ、G-17、PGⅡ水平变化

与空白组比较,模型组血清PGⅠ、G-17水平均显著降低(P<0.05);与模型组比较,脾胃培源方组和维酶素组PGⅠ、G-17水平显著上升(P<0.05);但维酶素组和脾胃培源方(高、中、低剂量组)4组间采取两两比较,差异无统计学意义(P>0.05);其中PGⅡ均未见明显变化(P>0.05),差异无统计学意义。见表1。

3.3  大鼠胃组织中TGF-β1、Smad3蛋白表达

与空白对照组比较,模型组胃组织TGF-β1蛋白表达显著升高(P<0.05),胃组织Smad3蛋白表达明显降低(P<0.05);与模型组比较,脾胃培源方组和维酶素组TGF-β1蛋白显著降低(P<0.05),胃组织Smad3蛋白表达显著升高(P<0.05),但维酶素组和脾胃培源方(高、中、低剂量组)4组间采取两两比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

4 讨论

CAG的发病机制与很多因素相关,其中幽门螺旋杆菌感染为主要因素[6]。临床上主要将胃功能三项作为监测、筛查与诊断的依据,其中包括PGⅠ、PGⅡ与G-17[7]。许多临床研究证实,CAG发生与PGⅠ、PGⅡ和G-17关系密切。孙雪飞等[8]通过胃镜及病理诊断筛选出CAG及慢性非萎缩性胃炎患者各100例,通过酶联免疫吸附法(ELISA)来定量测定患者空腹血清PGⅠ、PGⅡ和G-17的水平,结果CAG患者血清PGⅠ、G-17数值明显低于慢性非萎缩性胃炎患者,且还发现幽门螺旋杆菌感染与PG水平有关。姚文君等[9]通过临床研究亦发现CAG患者血清PGⅠ、G-17水平较健康体检者、胃溃疡、十二指肠球部溃疡患者均偏低。以上均表明胃蛋白酶原和胃泌素能够明显影响CAG的发生。

CAG发生是多因素、多环节的演变过程,TGF 是人体中的一种多功能生长调节因子,其中TGF-β在此过程中有着相当重要的作用。TGF-β是一类细胞因子家族具有多种不同的生物学功能,其中以 TGF-β1含量最高,最具有代表性[10]。TGF-β1调节着细胞生长和分化,能使正常的成纤维细胞的表型发生转化,抑制癌变早期细胞[11]。TGF-β1在细胞调亡中起传导信号的作用,能调节正常免疫稳态,调节细胞调亡,控制肠上皮化生,而Smad3蛋白属受体调节型蛋白,与TGF-β1共同参与胃黏膜细胞的生长抑制调节,是CAG形成的重要指标[12]。CAG发生的原因之一为随着胃内pH值的增加,TGF-β1因子含量增加[13],TGF-β1成纤维细胞因子可促进人体有丝分裂原以及趋化因子运作,Smad3蛋白参与并加速TGF-β1成纤维细胞因子的作用,有效促进胃部内间质纤维化生成[14],从而人体纤维细胞被同时激活,进而导致平滑肌细胞增生,最终导致CAG发生[15]。

中医学将CAG归属于“胃脘痛”“痞满”等范畴。本病的病机多为“脾胃虚弱,气滞血瘀”。脾胃培源方是首届全国名老中医马骏教授结合临床经验制定的治疗脾胃病的经验方,主要由炙黄芪、石斛、桂枝、白术、香附、莪术等组成,有益气和中、培补脾胃之功。炙黄芪与白术益气补中、补脾益胃共为君药,石斛与莪术合用厚肠胃、化滞消积、散结止痛为臣药,桂枝解表和营、温化水气、补脾益气为佐药,香附具有和胃理气、疏肝止痛为使药。诸药结合,相辅相成,共奏培源固本、培补脾胃之功效。

本次实验从信号传导通路层面研究脾胃培源方对CAG大鼠的干预作用,结果显示脾胃培源方是通过有效下调TGF-β1的表達和上调Smad3的表达,从而达到治疗效果。总之,CAG的发病是多因素、多环节作用的结果,可以初步推断脾胃培源方通过对TGF-β1/Smad3信号通路及其下游的相关细胞因子的影响发挥其治疗作用,抑制异型增生细胞的增殖、促进胃黏膜损伤的修复。

参考文献

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