黄芪多糖对C17.2神经干细胞定向分化的调控作用

叶妮 马金昀 程晓东

摘要 目的：观察黄芪多糖（APS）对C17.2神经干细胞体外定向分化的调控作用。方法：建立C17.2神经干细胞的体外培养体系及分化模型，设置APS干预组及PBS对照组。诱导分化4 d后，通过细胞免疫荧光染色的方法检测2组细胞中神经干细胞的标志性蛋白巢蛋白（Nestin）、星形胶质细胞的标志性蛋白胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、少突膠质细胞的标志性蛋白髓鞘碱性蛋白（MBP）及神经元的标志性蛋白神经元特异性核心抗原（NeuN）的表达水平。结果：与PBS对照组比较，APS干预组细胞的Nestin及GFAP蛋白表达水平明显下调，MBP及NeuN蛋白表达水平明显上调，差异有统计学意义（P<0.05）。APS下调了分化模型中的细胞Nestin蛋白的表达水平;APS下调了GFAP蛋白的表达水平，上调了MBP及NeuN蛋白的表达水平。结论：APS可抑制C17.2神经干细胞向星形胶质细胞的定向分化，促进向少突胶质细胞及神经元的定向分化，APS可抑制C17.2神经干细胞的干性维持，促进其进入分化状态，有可能成为治疗神经退行性疾病的潜在药物。

关键词 神经干细胞;定向分化;黄芪多糖;少突胶质细胞;神经元;星形胶质细胞;神经退行性疾病;体外研究

Abstract Objective：To observe regulatory effects of Astragalus Polysaccharide（APS）on directional differentiation of C17.2 neural stem cells in vitro.Methods：Cultivation system and differentiation model of C17.2 neural stem cells were established in vitro.APS intervention group and PBS control group were set up.Immunofluorescence staining was used to detect expression levels of Nestin，GFAP，MBP and NeuN，the simbolic marker proteins of neural stem cells，astrocytes，oligodendrocytes and neurons，so as to explore the regulatory effects of APS on directional differentiation of C17.2 neural stem cells.Results：Compared with the PBS control group，the expression levels of Nestin and GFAP proteins in the APS intervention group were down-regulated while the expression levels of MBP and NeuN proteins were up-regulated.The differences were statistically significant（P<0.05）.APS down-regulated the expression level of Nestin protein in the differentiation model，which meant it could inhibit the stemness maintenance of C17.2 neural stem cells and lead them to enter the differentiation state.APS down-regulated the expression level of GFAP protein，and up-regulated the expression levels of MBP and NeuN proteins，which meant it could promote C17.2 neural stem cells to differentiate into oligodendrocytes and neurons directionally，and inhibit them to differentiate into astrocytes.Conclusion：APS can effectively regulate the directional differentiation of C17.2 neural stem cells in vitro，which suggests that it might be a potential drug for the treatment of neurodegenerative diseases.

Key Words Neural stem cells; Directional differentiation; Astragalus polysaccharides; Oligodendrocytes; Neurons; Astrocytes; Neurodegenerative diseases; Study in vitro

中图分类号：R284 文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.10.012

神经干细胞（Neural Stem Cell，NSC）是指一类可以自我更新，主要分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞及神经元细胞，广泛存在于胚胎及成年哺乳动物的中枢神经系统中[1]。由于具有多向分化的潜能，神经干细胞自1992年发现以来便备受关注，有望成为治疗神经退行性疾病（Neurodegenerative Diseases，ND）的种子细胞[2]。随后的研究发现，在体外自然分化状态下，神经干细胞绝大多数分化为星形胶质细胞，分化为神经元的比例次之，最小一部分分化为少突胶质细胞[3]。在ND的动物模型体内移植研究中也发现，移植的神经干细胞往往不能有效分化为目标细胞群[4]。因此，适当调控神经干细胞的定向分化，促进目标细胞的再生，或可成为治疗ND的有效手段。C17.2神经干细胞是美国哈佛大学Snyder教授将V-myc基因转入到小鼠小脑原代神经干细胞中，而构建的永生化细胞系。它具有神经干细胞的所有特征，是用来研究中枢神经系统细胞再生的理想工具[5]。巢蛋白（Nestin）、胶质纤维酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein，GFAP）、髓鞘碱性蛋白（Myelin Basic Protein，MBP）、神经元特异性核心抗原（Neuron Specific Nuclear Protein，NeuN）分别是公认的神经干细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞及神经元的标志性蛋白[6-8]。本研究通过检测Nestin、GFAP、MBP、NeuN蛋白的表达水平，探讨中药黄芪的主要活性成分——黄芪多糖（Astragalus Polysaccharide，APS）对C17.2神经干细胞体外定向分化的调控作用。565BAB24-E58C-4B62-BC45-301E26F8074C

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 C17.2神经干细胞由上海交通大学纳米生物医学工程研究所提供。

1.1.2 药物 黄芪多糖（UV≥98%）购自上海源叶生物科技有限公司。黄芪多糖粉末用PBS缓冲液配成5 mg/mL母液，0.22 μm滤器过滤后4 ℃保存备用。

1.1.3 试剂与仪器 DMEM高糖培养基、马血清、青链霉素、胰蛋白酶购自美国Gibco公司;胎牛血清、磷酸盐缓冲液（PBS）购自美国HyClone公司;一抗：Nestin小鼠单抗（ab11306）、GFAP山羊多抗（ab53554）、MBP兔多抗（ab40390）、NeuN兔多抗（ab128886）购自英国Abcam公司;荧光二抗：山羊抗小鼠IgG-Cy3（115-165-003）、兔抗山羊IgG-Cy3（305-165-003）、山羊抗兔IgG-Cy3（111-165-003）购自美国Jackson公司;多聚甲醛、Triton-X、牛血清白蛋白（BSA）、DAPI水溶液、抗淬灭封片剂等为国产。荧光显微镜购自德国Leica公司。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 实验设置黄芪多糖干预组及PBS对照组。参照Li等[9]的方法建立C17.2神经干细胞的体外培养体系及分化模型。增殖培养液：84%DMEM高糖+10%胎牛血清+5%马血清+1%双抗。分化培养液：98.5%DMEM高糖+0.5%胎牛血清+1%雙抗。培养条件：37 ℃，5%CO2。体外培养体系的建立：使用增殖培养液以2×103/cm2的密度将细胞接种至培养瓶，待细胞长到底部80% ～90%融合度时按1∶ 5比例传代。分化模型的建立：取体外培养体系中处于对数生长期的细胞，使用增殖培养液将细胞以2×103/cm2的密度接种至铺有专用细胞爬片的6孔板，培养24 h后吸弃原培养液，换分化培养液。每2天换新的分化培养液，培养4 d以建立分化模型。

1.2.2 给药方法 依据文献查阅和本实验室的前期研究结果，将黄芪多糖的作用浓度设定为0.1 mg/mL[10-11]。黄芪多糖干预组使用分化培养液将黄芪多糖母液稀释至0.1 mg/mL;PBS对照组在分化培养液中加入与黄芪多糖母液等体积的PBS。诱导分化4 d后，进行细胞免疫荧光染色，检测Nestin、GFAP、MBP及NeuN蛋白的表达水平，该实验独立重复3次。

1.2.3 检测指标与方法 取体外培养体系中C17.2神经干细胞，使用增殖培养液将细胞以2×103/cm2的密度接种至铺有专用细胞爬片的6孔板。培养48 h后，进行细胞免疫荧光染色检测神经干细胞的标志性蛋白Nestin、星形胶质细胞的标志性蛋白GFAP、少突胶质细胞的标志性蛋白MBP及神经元的标志性蛋白NeuN的表达水平，以鉴定该细胞处于未分化状态。

取出6孔板，吸弃培养液，用4 ℃预冷的PBS清洗1次。4%多聚甲醛室温固定30 min后，PBS清洗3次。0.3%Triton-X破膜10 min，PBS清洗3次。1%BSA封闭1 h，吸弃BSA。加入95%PBS+5%胎牛血清稀释的一抗工作液，稀释比例：Nestin（1∶ 100）、GFAP（1∶ 200）、MBP（1∶ 180）、NeuN（1∶ 200），4 ℃孵育过夜。PBS替代一抗工作液作为阴性对照。次日早晨吸弃一抗工作液，PBS清洗3次，加入95%PBS+5%胎牛血清稀释的二抗工作液，稀释比例均为1∶ 1 000，室温避光孵育1 h。吸弃二抗工作液，PBS清洗3次后，加入DAPI水溶液，室温避光孵育10 min，PBS清洗3次。将细胞爬片从6孔板中取出，滴加少量抗淬灭封片剂后盖于载玻片上，荧光显微镜下观察。每张细胞爬片随机取5个无重叠的高倍镜（200倍）视野拍照，记录阳性细胞数及总细胞数，计算阳性细胞比例。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，先行正态分布及方差齐性检验，服从正态分布且方差齐者，采用独立样本t检验;不服从正态分布或方差不齐者，采用Wilcoxon秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞鉴定 经细胞免疫荧光染色检测发现，处于体外培养体系的C17.2神经干细胞几乎全部表达Nestin蛋白，占（98.62±3.51）%，极少表达GFAP、MBP、NeuN蛋白，表明此时C17.2细胞处于未分化状态，可以用于下游分化实验。见图1。

2.2 黄芪多糖对C17.2神经干细胞干性维持的影响 经细胞免疫荧光染色检测发现，分化模型中的PBS对照组细胞表达的Nestin蛋白水平较在体外培养体系有所下调。分化模型中的黄芪多糖干预组细胞表达的Nestin蛋白水平较PBS对照组进一步下调，PBS对照组中表达Nestin蛋白的细胞占（19.38±6.50）%，黄芪多糖干预组中表达Nestin蛋白的细胞占（11.09±4.32）%，差异有统计学意义（P<0.05）。黄芪多糖下调了分化模型中的细胞表达Nestin蛋白的水平。见图2。

2.3 黄芪多糖对C17.2神经干细胞向星形胶质细胞定向分化的影响 经细胞免疫荧光染色检测发现，分化模型中的黄芪多糖干预组细胞表达的GFAP蛋白水平较PBS对照组明显下调，PBS对照组中表达GFAP蛋白的细胞占（43.22±12.21）%，黄芪多糖干预组中表达GFAP蛋白的细胞占（8.00±2.72）%，差异有统计学意义（P<0.05）。黄芪多糖下调了分化模型中的细胞表达GFAP蛋白的水平。见图3。

2.4 黄芪多糖对C17.2神经干细胞向少突胶质细胞定向分化的影响 经细胞免疫荧光染色检测发现，分化模型中的黄芪多糖干预组细胞表达的MBP蛋白水平较PBS对照组明显上调，PBS对照组中表达MBP蛋白的细胞占（6.55±3.26）%，黄芪多糖干预组中表达MBP蛋白的细胞占（28.73±8.95）%，差异有统计学意义（P<0.05）。黄芪多糖上调了分化模型中的细胞表达MBP蛋白的水平。见图4。565BAB24-E58C-4B62-BC45-301E26F8074C

2.5 黄芪多糖对C17.2神经干细胞向神经元定向分化的影响 经细胞免疫荧光染色检测发现，分化模型中的黄芪多糖干预组细胞表达的NeuN蛋白水平较PBS对照组明显上调，PBS对照组中表达NeuN蛋白的细胞占（7.79±3.29）%，黄芪多糖干预组中表达NeuN蛋白的细胞占（16.36±5.02）%，差异有统计学意义（P<0.05）。黄芪多糖上调了分化模型中的细胞表达NeuN蛋白的水平。见图5。

3 讨论

神经退行性疾病（Neurodegenerative Diseases，ND）是指一类由慢性进行性中枢神经组织退行性变而引起的疾病，包括以神经元变性、死亡为特征的阿尔茨海默病（Alzheimer Disease，AD）、帕金森病（Parkinson Disease，PD）、脑卒中（Stroke）等，以及以少突胶质细胞死亡为特征的多发性硬化（Multiple Sclerosis，MS）、脊髓损伤（Spinal Cord Injury，SCI）、佩梅病（Pelizaeus-Merzbacher Disease，PMD）等[12]。目前，临床上治疗ND的药物仅可以有限地延缓神经退变进程，不能有效地修复死亡的细胞[13]。如何在不同病理特征的ND中，获得大量缺失的细胞，已成为神经科学领域的研究热点。近年的研究发现，ND中均伴有星形胶质细胞的异常激活和增殖，它们可分泌大量的炎性反应递质，促进疾病的发展，以及形成致密的胶质瘢痕，阻碍抗炎细胞因子修复病灶[14]。适度地抑制星形胶质细胞的产生，促进神经元或少突胶质细胞的再生，便可以有效地治疗ND。20世纪90年代，发育生物学证明，星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元均由神经干细胞发育分化而来[2]。在成年健康脑中，神经干细胞处于相对静止的状态;在疾病状态下，神经干细胞被激活，根据微环境的诱导而增殖、迁移、分化为缺失的细胞，以修复病灶[15]。在ND动物模型的研究中发现，此时激活的神经干细胞大多分化为星形胶质细胞，分化为少突胶质细胞或神经元的比例很低，这与体外研究的结论一致[3-4]。本研究也发现，体外低血清培养可诱导C17.2神经干细胞自然分化。因此，适度调控神经干细胞的定向分化，便可促进少突胶质细胞或神经元的再生，同时又可抑制星形胶质细胞的过度增殖，这已成为治疗ND的新思路。

黄芪多糖是中药黄芪的主要活性成分之一，也是主要发挥免疫调节作用的成分[16]。本实验室已经发现，黄芪多糖具有明显的神经保护作用，在体内可有效缓解MS的动物模型——实验性自身免疫性脑脊髓膜炎（EAE）小鼠的神经功能障碍，抑制脊髓脱髓鞘，抑制外周和中枢免疫系统中过度的炎性反应;在体外可有效抑制脂多糖诱导的BV-2神经小胶质细胞的活化，抑制炎性反应递质的分泌[11]。有研究发现，黄芪多糖可以促进大鼠原代神经干细胞的增殖，并保护其免受缺氧诱导的细胞损伤[17-18]。在PD、脑缺血、脑出血以及缺血后再灌注的动物模型研究中，黄芪多糖被证明还有抑制神经元凋亡的作用[19-22]。然而，其对于神经干细胞的定向分化是否具有调控作用，能否促进少突胶质细胞或神经元的再生，至今仍不清楚。研究采用Nestin、GFAP、MBP、NeuN分别作为神经干细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞及神经元的标志性蛋白，通过细胞免疫荧光染色的方法检测其表达水平，探讨黄芪多糖对C17.2神经干细胞体外定向分化的调控作用。本研究发现，黄芪多糖在0.1 mg/mL的浓度下可有效调控C17.2神经干细胞的定向分化。黄芪多糖干预后，分化模型中的细胞表达Nestin蛋白水平明显下调，表明此时神经干细胞已不能维持其产生与亲代细胞相同的子代细胞的能力，失去了干细胞的特征，而进入分化状态。已分化的细胞中有（28.73±8.95）%分化为少突胶质细胞，（16.36±5.02）%分化为神经元，分化为星形胶质细胞的比例下降至（8.00±2.72）%，与PBS对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。表明黄芪多糖可以抑制C17.2神经干细胞的干性维持，促进其进入分化状态，促进少突胶质细胞和神经元的再生，抑制星形胶质细胞的产生。

综合分析ND的发病机制、少突胶质细胞和神经元再生的相关分子信号以及黄芪多糖的作用特点，以下机制可能参与了黄芪多糖调控神经干细胞的定向分化过程。1）抗氧化应激。ND患者均伴有明显的中枢神经系统氧化还原失衡现象，而少突胶质细胞和神经元对活性氧物质（Reactive Oxygen Species，ROS）、活性氮物质（Reactive Nitrogen Species，RNS）及各级代谢产物尤为敏感，极易引起死亡和变性[23]。有研究发现，黄芪多糖在四氯化碳诱导的肝炎大鼠模型中，有明显的抗氧化应激作用[24]。因此，抗氧化应激可能是其发挥调控作用的机制之一。2）調节神经免疫反应。中枢神经系统内过度的免疫反应是ND的另一病理特点，例如在AD和MS患者脑中都存在神经小胶质细胞、T细胞的异常激活，它们可形成强大的免疫级联，互相活化，分泌大量的炎性反应递质和炎性趋化因子，引发少突胶质细胞和神经元的大面积凋亡[25]。黄芪多糖已被证明有显著的调节神经免疫反应的作用，例如它可以有效抑制脂多糖诱导神经小胶质细胞的活化，抑制炎性反应递质白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α、核因子-κB的分泌[11，26]。因此，调节神经免疫反应或成为黄芪多糖调控神经干细胞定向分化的潜在机制之一。3）调控神经发育相关的信号通路。有研究证明，TGF-β/Smad、Sonic Hedgehog、Notch、Wnt/β-catenin、MAPK等是参与胚胎时期神经组织发育的主要信号通路[27]。具体地，TGF-β/Smad等通路主要影响星形胶质细胞的发育，Sonic Hedgehog等通路主要影响少突胶质细胞的生长，Wnt/β-catenin等通路主要影响神经元的生长。黄芪多糖有可能是通过调节这些信号通路的活性，从而促进少突胶质细胞和神经元的再生，抑制了星形胶质细胞的产生。565BAB24-E58C-4B62-BC45-301E26F8074C

本研究通過体外实验，发现黄芪多糖可有效地调控C17.2神经干细胞的定向分化，有可能成为治疗ND的潜在药物。在此基础上，本研究将进一步探讨黄芪多糖调控神经干细胞定向分化的细胞分子机制，以及完善动物实验，以期能为临床上治疗ND提供新的方法。

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（2018-09-06收稿 责任编辑：杨觉雄）565BAB24-E58C-4B62-BC45-301E26F8074C