米渣肽双酶两步水解法制备过程中物化特性与结构变化

黄金梅，胡居吾，高红，熊华，赵强*

1(食品科学与技术国家重点实验室(南昌大学),江西 南昌, 330047)2(江西省科学院,应用化学研究所,江西 南昌, 330096)3(德州乡盛食品有限公司,山东 德州, 253009)

酶解法是目前生产活性肽的最主要方法，其优点是产品安全性高，生产条件温和高效，对蛋白质营养价值破坏小，可生产特定的功能肽[1]。酶解法主要分为单一酶解法、分步水解法和复合酶法，其中单一蛋白酶解法对蛋白大分子进行水解获得活性肽是文献中报道最多的方法。然而，该法在水解反应一段时间后酶活力易于降低，同时酶作用位点的消失常使水解达到一个平台期，水解效率下降，使得活性肽的得率相对较低。利用多种蛋白酶组合可克服以上不足，不仅能提高水解效率，缩短酶解时间，更能显著提高活性肽的产量[2]。张红梅等[3]采用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶复合酶解制备大豆蛋白肽，经工艺优化后水解度可达23.43%；林琳等[2]采用中性蛋白酶和胰蛋白酶协同水解小麦面筋蛋白，酶解产物DPPH清除率可达91.86%。另外，蛋白酶的复配使用存在酶的复配比例、反应条件不好控制，以及酶的相互作用等干扰因素，复合酶法的使用易受到限制。因此，针对不同底物，采用2种及以上酶分步水解的方法，具有不同选择性与不同酶水解位点灵活性，以及实现深度水解且提高水解产物质量的特点，如陈晶等[4]采用酶分步水解法较单独使用复合蛋白酶或风味蛋白酶的水解度分别提高11.07%，9.81%，同时氮回收率分别提高了5.17%，13.22%。

米渣是生产淀粉和糖浆的副产物，其中蛋白质量分数高达40%～60%，是不可多得的优质蛋白资源。由于其加工过程经历热变性，导致溶解性较差，以致利用率低[5]。酶法是一种有效改善米渣蛋白性能的方法，同时可得到具有优良生物活性与生理功能的大米蛋白肽，如易吸收，低过敏源性，具有降血压，抗氧化，调节免疫，降低胆固醇等[6-7]功效。前期研究报道有关米渣肽的制备，多以单酶法和复合酶法为主。如ZHAO等[8]采用5种商用蛋白酶分别对米渣蛋白进行酶解，发现复合蛋白酶酶解产物的功能性质及抗氧化性较好，同时推测碱性蛋白酶与中性蛋白酶复配可能具有较优的酶解效果。黄声芳等[9]发现胰蛋白酶和复合蛋白酶复配对提高米渣蛋白改性产物的溶解度作用明显。王素芳[10]比较米渣蛋白的酶解结果发现中性蛋白酶和胰蛋白酶的酶解物具有较好的溶解性、疏水性及乳化稳定性。然而，双酶分步水解法在米渣肽开发方面的研究较为少见。另一方面，文献中有关肽的理化性质的研究主要是分析终产物[11-13]，对于酶解过程的文献报道较少，而有关米渣肽的理化性质在酶解进程中的变化研究则更少见。

因此，本文尝试采用胰蛋白酶或中性蛋白酶与风味蛋白酶双酶分步法制备米渣肽，通过分析蛋白水解度、粒径、表面疏水性、巯基含量、内源荧光、红外等指标，探究酶解过程中肽的组成结构变化，揭示双酶法制备米渣肽过程变化规律，以期为酶解米渣肽的进一步研究奠定基础，更为制备理化性质和功能活性优良的蛋白肽提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

脱脂米渣，江西恒顶食品有限公司；胰蛋白酶(4 000 U/g)、ASI.398中性蛋白酶(50 000 U/g)、风味蛋白酶(500 LAPU/g)，诺维信(中国)生物技术有限公司； 8-苯胺-1-萘磺酸、5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，美国Sigma公司。

Nano-ZSE马尔文粒度电位仪，英国Malvern公司；F-7000荧光分光光谱仪，日本日立公司；Nicolet 5700傅里叶变换红外光谱仪，美国Thermo Nicolet公司；TU-1900双光束紫外可见光分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；S-443D型氨基酸分析仪，德国SYKAM公司。

1.2 方法

1.2.1 米渣肽的制备

称取一定质量的脱脂米渣(rice dreg protein，RDP)，以1∶10的固液比加入蒸馏水，根据前期研究[8-10, 14]，选择胰蛋白酶与ASI.398中性蛋白酶，酶占底物质量的1%，按照表1设置的条件分别对米渣进行水解2 h，每隔30 min取1次样，沸水处理10 min， 4 000 r/min离心取上清液。水解完成后按照残留总底物质量加入1%风味蛋白酶，对底物继续进行水解2 h，每隔30 min取样，沸水处理10 min，离心取上清冻干，得到两大类样品RDPH-1和RDPH-2。酶解4 h结束时，相对于原料米渣蛋白，RDPH-1和RDPH-2的得率分别为(38.90±1.82)%和(42.22±0.81)%。

表1 酶的种类及酶解最适条件Table 1 Types of enzymes and optimal conditions for enzymatic hydrolysis

1.2.2 酶解进程中水解度(the degree of hydrolysis，DH)的测定

根据赵新淮等[15]的方法，取灭酶后的5.0 mL水解液，置于150 mL的烧瓶中，加60 mL蒸馏水，调节pH值8.2。向烧瓶中加入10.0 mL pH 8.2的甲醛溶液，混匀。开动磁力搅拌器，用0.01 mol/L的NaOH标准溶液滴定至pH值为9.20，记录下此时滴定管中NaOH溶液的体积消耗量V(mL)。同时，取相同浓度未水解蛋白溶液5.0 mL，按上述方法作空白实验，记录此时滴定管中NaOH标准溶液的体积消耗数V2(mL)。米渣蛋白的水解度的计算见公式(1)：

(1)

式中：M为NaOH标准溶液的浓度，mo1/L；V1为滴定样品稀释液消耗的0.01 mol/L NaOH标准溶液的体积，mL；V2:为空白实验所消耗0.01 mol/L NaOH标准溶液的体积,mL；CWD为所用米渣溶液的蛋白质量浓度，g/L；V为用于甲醛滴定的水解液的体积数，mL；htot为每克原料蛋白质中肽键的毫摩尔数，本文中该值取7.40。

1.2.3 酶解进程中样品粒径的测定

利用马尔文粒度仪测定米渣肽RDPH-1和RDPH-2的粒径。取1 mL的肽溶液(1.0 g/L)加入样品池，控制不要产生气泡。分别测定不同水解时间样品溶液的粒径，平行测定3次[16]。

1.2.4 酶解进程中样品内源荧光的测定

RDPH-1和RDPH-2在不同水解时间的样品用0.01 mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液配制成1.0 g/L溶液，磁力搅拌1 h后测定其内源荧光。荧光分光光度计设置激发波长为290 nm，发射波长为300～400 nm， 激发和发射狭缝均为5 nm[17]。

1.2.5 酶解进程中样品表面疏水性的测定

根据SUH等[18]描述的方法，使用1-苯胺基-8-萘磺酸(1-anilino-8-naphthalenesulfonate,ANS)作为荧光探针测量蛋白质水解产物的表面疏水性(H0)。将样品溶解在0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，使质量浓度达到0.15 g/L，并继续将储备溶液从0.015%连续稀释至0.001 5%。取2 mL不同浓度的稀释样品，分别加入20 μL ANS，快速混合，静置3 min后进行荧光测试。设定激发波长为390 nm，发射波长为470 nm。将荧光强度相对于蛋白质浓度作图，初始斜率是蛋白质的表面疏水性(H0)。

1.2.6 酶解进程中样品巯基含量的测定

通过略微修改，巯基的含量根据HE等[19-20]的方法进行测定。采用去离子水将每个样品稀释至10 g/L的溶液，分取0.5 mL溶液加入到2.5 mL含有8 mol/L尿素的Tris-甘氨酸缓冲液(0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L甘氨酸，0.004 mol/L EDTA，pH 8.0)中。加入20 μL Ellman’s试剂(4 g/L)后，将溶液在室温下温育15 min,412 nm下进行吸光度测试。总巯基(SH)的计算如公式(2)：

(2)

式中：D为稀释指数,1.01；C为蛋白质量浓度(g/L)；A412为在412 nm处的吸光值。

1.2.7 傅里叶红外光谱分析

称取约5 mg样品与200 mg干燥的KBr置于玛瑙研钵中混合研磨均匀，放入锭剂成型器中，加压处理得到一定直径及厚度的透明片，采用傅里叶红外光谱仪测定波长4 000～400 cm-1的吸收光谱，分辨率4 cm-1，扫描次数32次[21]。

1.2.8 氨基酸组成的测定

依据所测样品中蛋白质的质量分数，称取适量的待测样品放入水解管中，加入6 mol/L HCl 10 mL，1 g苯酚，充氮气处理约10 min，水解管封好后置于110 ℃的烘箱中水解 24 h；水解完毕后，用超纯水将水解管中的溶液定容至50 mL。取适量定容后的样品0.5～1 mL，60 ℃水浴蒸干，加入适量超纯水溶解，重复蒸干1～2次，最后加入样品稀释液3～5 mL复溶。振荡混匀过0.22 μm微滤膜，氨基酸自动分析仪测定样品中的氨基酸质量分数[22]。

2 结果与分析

2.1 酶解进程中水解度的变化

水解度是蛋白质酶解过程中衡量肽链断裂程度的重要指标。图1反映了随着时间的延长水解度呈增长趋势。连续水解的第一阶段(0～2 h)分别加入胰蛋白酶和中性蛋白酶，胰蛋白酶在前30 min反应迅速，水解度达到7%，而中性蛋白酶反应缓慢，水解度甚至不到2%。第二阶段(2～4 h)加入风味蛋白酶后反应体系继续水解，水解度随着时间延长继续增加，同样在 30 min的增速较为迅猛，反应结束时RDPH-1的水解度(29.09±0.24)% 显著高于RDPH-2的水解度(16.47±0.93)%，并且显著高于单一的蛋白酶对米渣蛋白进行处理的水解度[8]。结果表明，胰蛋白酶+风味蛋白酶比中性蛋白酶+风味蛋白酶水解米渣蛋白相对更完全，并且与JIN等[23]利用碱性蛋白酶和风味蛋白酶酶解玉米蛋白肽的水解度达到了21.02%相似。由于不同的蛋白酶具有不同的酶切位点和催化特性，胰蛋白酶主要作用于蛋白质氨基酸肽链中的赖氨酸和精氨酸残基，较中性蛋白酶广泛特异性处理米渣蛋白更具有针对性，配合酸性的风味蛋白酶的广泛特异性，复合使用会增强酶对米渣蛋白的水解作用，使单一的酶解效果得到改善，从而获得更多的小分子肽。

图1 酶解过程水解度随时间变化情况Fig.1 Degree of hydrolysis of RDP as influenced by time

2.2 酶解进程中样品粒径的变化

图2是RDPH-1和RDPH-2的不同水解时间粒径变化分布曲线，两者的粒径分布大部分集中在<1 000 nm。 RDPH-1在酶解初始阶段(30～90 min)粒径逐渐增加，120～180 min粒径减小，直至酶解240 min粒径增加。RDPH-2除了在120 min的粒径减小，其余时间的粒径变化与RDPH-1类似。这表明酶解是一个动态的过程，蛋白质水解产生肽或氨基酸，同时发生着重新聚集的现象，控制条件尚不明确。据文献报道，低分子质量肽的存在可促进Plastein的形成，是一种具有疏水性质的大分子物质，而Plastein反应是蛋白酶诱导的肽聚集过程。FUJIMAKI等[24]报道使用微生物蛋白酶使水解度增加的同时可导致蛋白质水解产物中形成的Plastein产率增加。因此，本实验过程中出现粒度变化推测可能是发生了Plastein反应，小分子肽又重新聚集或形成新的类似蛋白

a-RDPH-1；b-RDPH-2图2 不同酶解时间米肽的粒径分布Fig.2 Particle size distribution of rice peptides at different enzymatic hydrolysis time

质的物质[25- 26]。对比之下，RDPH-1较RDPH-2酶解过程中的粒径较大，可能的原因是胰蛋白酶水解产物进一步发生Plastein反应的程度应该更高。

2.3 酶解进程中样品内源荧光的变化

蛋白质的内源性荧光光谱分析，可反映蛋白质的三级结构变化。蛋白质的荧光发射峰的最大吸收波长红移，λmax增大，而蛋白质的荧光发射峰的最大吸收波长蓝移，λmax减小，红移或蓝移的大小能体现出蛋白质构象发生改变的程度。一般来说，最大吸收波长的红移表明荧光发射基团暴露在溶剂中，蛋白质分子展开；如果最大吸收波长没有发生偏移现象，只有荧光强度的变化，则不能判断为明显的蛋白构象发生改变[27]。从图3可以看出，不同时间得到的米肽产物的内源荧光发生了变化，RDPH-1的λmax大小顺序为120、180、90、240、60、30 min，RDPH-2的λmax大小顺序为180、240、90、60、120、30 min，酶解初始30 min的内源荧光λmax都比之后水解样品的内源荧光的λmax低，内源荧光发射峰的最大吸收波长发生了不同程度的红移，并且最高峰荧光强度也有改变，这表明水解过程中蛋白质构象明显发生了改变，同时两种酶解体系产物的荧光强度差异性明显。

a-RDPH-1；b-RDPH-2图3 不同酶解时间米肽的内源荧光变化情况Fig.3 Changes in endogenous fluorescence of rice peptides at different enzymatic hydrolysis time

2.4 酶解进程中表面疏水性的变化

蛋白质表面疏水性，就是指在水相环境中，蛋白质分子表面的疏水性残基的数目。将蛋白质进行适度的水解可引起蛋白质部分变性，导致分子结构疏松，埋藏在分子内部的疏水性肽段暴露在溶剂中，使蛋白质的表面疏水性发生变化。RDPH-1和RDPH-2的表面疏水性都随时间的变化呈现一定的规律，如图4所示，不同时间的RDPH-1的表面疏水性有着显著差异(P<0.05)，随着时间的增加表面疏水性先快速下降又逐渐增加，在60 min时表面疏水性最低，240 min时达到最高，为3 622.50±45.07，这表明有大量疏水性片段生成，与杨瑾[28]的研究发现较为一致，适度的酶解可使表面疏水性增加，但随着酶解的进行表面疏水性减小。RDPH-2的各个样品的表面疏水性也有类似的变化规律，然而变化较为缓慢，部分样品之间有显著性差异，且在90 min时表面疏水性为最低(22.04±1.13)。在酶解初期，可能是由于蛋白酶的作用，蛋白质表面疏水基团开始外露，使得表面疏水性增加，但随着酶解反应的进行，表面外露的疏水基团被水解导致表面疏水性下降；进一步的酶解产生肽段的过程，使更多疏水性氨基酸残基暴露出来，从而增大了表面疏水性，尤其是在风味蛋白酶加入后，表面疏水性继续增加，这与郭延熙等[29]发现米糠酶解物表面疏水性指数在不同酶解时间的变化规律相类似。同时可以发现，RDPH-1的表面疏水指数较RDPH-2整体大10倍多，表明胰蛋白酶较中性蛋白酶水解米渣蛋白能力更强，并且在风味蛋白酶的作用下，水解进一步大幅提升，与水解度曲线结果较为一致。

a-RDPH-1；b-RDPH-2图4 不同酶解时间米肽的表面疏水性Fig.4 Surface hydrophobicity of rice peptides at different enzymatic hydrolysis time注：不同字母代表差异显著，P<0.05。

2.5 酶解进程中样品总巯基含量的变化

巯基是一种能清除自由基的化学基团，存在于蛋白分子中能发挥抗氧化作用。双酶法水解米渣蛋白在不同时间制备的米肽的巯基含量变化如图5所示。

图5 不同酶解时间米肽的总巯基含量Fig.5 Surface hydrophobicity of rice peptides at different enzymatic hydrolysis time注：a-c或m-n字母不同分别表示差异显著，P<0.05。

由图可知对于RDPH-1，在60 min时米肽产物总巯基含量相对于30 min产物显著增加，表明胰蛋白酶直接降解了米渣蛋白中的部分二硫键，形成了更多的巯基；之后出现大幅度下降，尤其是在120 min后，但随着水解度增大巯基含量变化不明显。减少的原因可能是水解进行到60 min后，米肽产物达到巯基含量的某种平衡，水解度越大，酶解促使米肽产物的巯基氧化，伴随着热作用也会导致巯基氧化成二硫键；而酸性的风味蛋白酶水解并没有改变米肽产物的巯基含量，可能是风味蛋白酶对米渣蛋白的水解不会氧化蛋白质的巯基基团，此时水解液的热稳定性有了较大的提高，同时游离的米肽会发生水解-聚集的动态变化，在120 min后，巯基变化不明显，此阶段对于RDPH-2也是一样的。对于RDPH-2的巯基含量在全程来看变化不大，可能是中性蛋白酶对于降解蛋白中的二硫键能力较弱，在反应达到90 min时巯基含量基本不再发生变化。在反应达到90 min后，RDPH-1较RDPH-2的水解度更大，但巯基含量则较小，推测RDPH-1发生Plastein反应的肽聚集程度更高，形成了更多二硫键，这与文中粒径的结果相一致。

2.6 蛋白二级结构的组成

傅里叶红外光谱分析蛋白质的二级结构研究主要基于酰胺Ι带，在1 600～1 700 cm-1，主要包含了C=O伸缩振动[30]，其中，1 650～1 658 cm-1为α-螺旋，1 610～1 640 cm-1为β-折叠，1 660～1 695 cm-1为β-转角，1 640～1 650 cm-1为无规卷曲。图6是RDP，RDPH-1和RDPH-2的红外图谱，经过酶解后峰位和峰强都发生了变化。3 400～3 500 cm-1向低波数方向发生了位移，峰型变宽，表示酰胺羰基沿着多肽骨架发生振动。图7即为米渣蛋白及其酶解4 h产物的红外光谱去卷积拟合图，从图中可以知道RDP的结构主要分为6个区域，RDPH-1光谱相比于RDP恰好蓝移了5 cm-1，而RDPH-2的频带也发生了移动，但整体相对于RDP较凌乱而无规律，表明酶解处理明显改变了蛋白质的结构，也证实了前面所讨论的特性反映出来的结构差异。表2是不同二级结构的质量分数，RDPH-1和RDPH-2的β-转角的含量分别为43.79%和49.47%，明显高于米渣蛋白的25.33%，其余3种结构的含量与米渣蛋白的相比都减少了。这可能是由于α-螺旋，β-折叠，无规卷曲损失导致了β-转角的增加，而转角结构被认为是蛋白质高度有序结构的产物[31]。结果进一步表明酶解处理改变了米渣蛋白的二级结构，能发现RDPH-1和RDPH-2结构有显著不同，表明两者由于水解蛋白酶的差异，导致最终在蛋白结构组成上可能存在较多不同之处。

图6 米渣蛋白及其酶解4h产物的红外光谱Fig.6 FTIR spectrum of RDP and rice peptides at enzymatic hydrolysis 4 h

a-RDP;b-RDPH-1;c-RDPH-2图7 米渣蛋白及其酶解4h产物的红外光谱去卷积拟合图Fig.7 Curve fitting results of deconvoluted FTIR spectra of RDP, RDPH-1, and RDPH-2 at enzymatic hydrolysis 4h

表2 米渣蛋白及其酶解4 h产物的二级结构组成Table 2 Secondary structure compositions of RDP and rice peptides at enzymatic hydrolysis 4 h

注：表中不同字母代表差异显著，P<0.05。

2.7 氨基酸组成

表3为水解4 h后2种不同的米肽RDPH-1和RDPH-2的氨基酸组成。由表可知，人体必需氨基酸种类齐全，天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、脯氨酸、亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸的含量较为丰富，并且两者的必需氨基酸分别为27.01、27.63 g/100 g。由此可知，尽管双酶法制备米肽所用酶不相同，各氨基酸的含量不尽相同，但主要的氨基酸种类较为一致，并且营养价值几乎相当。蛋白水解物的氨基酸组成与其活性有关，如Tyr，Met，His，Lys，通常被认为有抗氧化活性[32]，RDPH-1和RDPH-2包含14.08和14.45 g/100 g以上的这几种氨基酸，表明它们有潜在的抗氧化活性。Glu对神经系统具有非常积极的作用，并且在运动期间也是有帮助的。Asp被认为对氧化脱氨有帮助，可降低血氨浓度，从而延缓疲劳的发生[33]。RDPH-1和RDPH-2的Asp分别为19.36和21.10 g/100 g，表明有潜在的缓解疲劳功能。

表3 酶解4 h样品的氨基酸组成单位:g/100 g 蛋白

3 结论

本文利用胰蛋白酶+风味蛋白酶，中性蛋白酶+风味蛋白酶进行双酶法酶解米渣蛋白，制备两种系列蛋白肽RDPH-1和RDPH-2，研究米渣连续水解过程，了解酶解的动态变化。发现随着反应时间的延长，前者较后者酶解更迅速，4 h后前者水解度比后者高13.62%；由于水解作用，米肽产物的粒度及结构发生变化，蛋白质内部疏水残基暴露，肽的表面疏水性先减后增；同时蛋白质分子内部的巯基被破坏，巯基含量降低；RDPH-1较RDPH-2的酶解产物结构更稳定，氨基酸主要组成成分相似，营养价值相当，但Asp，Tyr，Met，His，Lys含量有差异。本研究为肽的高效制备提供了一定的理论基础。