蜂胶、蜂蜡复合涂膜剂对双孢蘑菇的保鲜作用

刘小霞，安学明，贠建民，李彦虎，牛耀星，赵风云

(甘肃农业大学 食品科学与工程学院，甘肃 兰州，730070)

双孢蘑菇(Agaricusbisporus,A.bisporus)是目前世界上人工栽培最广泛、产量最高、消费量最大的食用菌，也是我国目前最大宗的出口创汇食用菌，具有重要的经济价值[1]。其味道鲜美、营养丰富，且具有一定的医疗保健的作用[2]。双孢蘑菇质地细嫩，表面没有显著的组织保护，保质期很短，是一种极易腐烂的食用菌[3-4]。目前，各国对双孢蘑菇的保鲜研究已经比较深入，包括低温冷藏、气调保鲜、辐照保鲜、化学涂膜剂等，冷藏及气调保鲜效果好，但成本高[5-8]。涂膜保鲜法操作简单，成本低廉，可有效延长食用菌贮藏期[9]。相对于单一涂膜剂，复合涂膜剂保鲜效果更好。复合涂膜剂一般由成膜基质辅以抑菌材料和助膜材料等组成[10]，其优势在于可有效保障涂膜剂的稳定性，加强抑菌、抗氧化等多方面的性能[11]，是一种既经济方便又安全有效的保鲜方法。

蜂胶是西方蜜蜂(Apismellifera)采集植物树脂，并混入蜂蜡、花粉及蜜蜂腺体分泌物后经蜜蜂咀嚼加工而成的一种黏稠物质[12]。蜜蜂利用蜂胶防止巢房内异物腐烂和病菌的传染[13]。郭东起等[14]利用不同浓度的蜂胶粗提液保鲜冬枣，发现可显著降低病原微生物侵染概率，进而降低冬枣贮藏中的腐烂指数，使冬枣保持较好的品质。CANDIR等[13]的研究表明，蜂胶提取液在4周内能有效防止樱桃的真菌腐败。蜂蜡是蜜蜂腹部蜡腺分泌出来的一种蜡质混合物[15]，具有可食用性、超疏水性和延展性，能在材料表面形成一层薄膜，具有成本低、经济实用等性能[16]。肖锡湘[17]利用蜂蜡保鲜剂保鲜南丰蜜桔，发现其不同程度地抑制了果实的呼吸强度，减少了营养物质的损耗，抑制水分蒸发，延长了蜜桔贮藏期。蜂胶、蜂蜡在果蔬保鲜方面单独应用较多，对混合保鲜的研究鲜有报道。

本文利用不同浓度的蜂胶溶液和蜂蜡溶液制作复合涂膜剂，利用响应面法对复合涂膜剂的配方进行优化后，对双孢蘑菇进行保鲜处理。通过测定贮藏期间双孢蘑菇的感官评分、褐变度、失重率、硬度、呼吸强度、可溶性蛋白、SOD、POD、CAT、PPO、MDA含量，腐烂指数及菌落总数等指标考察其保鲜效果，以期筛选出一种新型可食性蜂胶蜂蜡复合涂膜剂的配方，为双孢蘑菇的保鲜提供一种新方法，也为将蜂胶蜂蜡应用于其他果蔬保鲜提供一定的理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验与材料

蜂胶：采自云南西双版纳植物园试验蜂场。

蜂蜡：于云南西双版纳植物园试验蜂场采集意蜂旧巢脾1 kg，采用蒸汽加热法进行制蜡[18]。

双孢蘑菇：采自于甘肃平凉金沃森科技有限公司灵台蘑菇基地，挑选新鲜、大小均匀、无明显机械损伤和褐变的蘑菇。

1.2 试剂与仪器

吐温80，重庆川东化工(集团)有限公司；NaOH，天津市大茂化学试剂厂；考马斯亮蓝G-250，重庆川东化工集团有限公司；75%乙醇，无锡市亚泰联合化工有限公司；硫代巴比妥酸，南京化学试剂有限股份公司。

FA1004B型电子天平，上海佑科仪器仪表有限公司；TCL-16型离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；UV-2450PC紫外可见分光光度计，日本岛津公司；HWS低温恒温恒湿箱，宁波东南仪器有限公司；722S可见光分光光度计，上海精密科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 单因素试验

蜂胶溶液：参考曹红刚等[19]方法，获得蜂胶溶液，用蒸馏水稀释成体积分数为0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%溶液备用。

蜂蜡溶液：称50 g蜂蜡于烧杯中，加热融化，同时搅拌至形成稳定的澄清油相，加入90 ℃的水制成体积分数为1%、1.5%、2%、2.5%、3%的蜂蜡溶液，冷却待用。

吐温80：吸取吐温80 20 mL，蒸馏水稀释成体积分数为1%、1.5%、2%、2.5%和3%溶液，待用。

保鲜方法：将预冷的双孢蘑菇单独浸泡于不同浓度的75%蜂胶溶液、蜂蜡溶液及吐温80涂膜剂中2 min， 冷风吹干后，用聚乙烯塑料筐盛放，每筐约500 g。在塑料筐外面套上保鲜袋后，迅速扎紧袋口，于4 ℃下贮藏，用蒸馏水作CK，以双孢蘑菇贮藏期的褐变度变化来考察涂膜剂的效果。

1.3.2 响应面试验设计

根据单因素试验优化结果，利用Design-Expert软件设计3因素3水平的响应面试验，如表1所示。

表1 双孢蘑菇响应面试验因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface test of A.bisporus

在响应面试验的基础上，以蒸馏水处理作为CK，测定腐烂指数、失重率、硬度、呼吸强度、可溶性蛋白、SOD、POD、CAT、PPO、MDA含量、菌落总数，以考察优化后的复合涂膜剂组合对双孢蘑菇的保鲜效果。

1.3.3 试验指标测定方法

褐变度测定：参照ZENG等[20]方法测定。测定取8 g双孢蘑菇，加1.6 g PVP于20 mL 0.2 mol/L pH 6.8的柠檬酸-磷酸缓冲液中，冰浴研磨，8 000×g离心10 min，取上清，于波长450 nm处测定吸光度值，用此值表示褐变程度。

失重率：采用称重法；硬度：硬度计测定；呼吸强度：采用静置法；可溶性蛋白：参照考马斯亮蓝测定法[21]； POD、CAT、SOD、PPO活性：参照曹健康等[21]方法测定；MDA：参照李合生[22]方法测定；菌落总数测定：参照GB4789.2—2016[23]测定；感官评价：参照李彦虎等[24]略作修改，选择食品专业的9人经专业培训，对双孢蘑菇的色泽、组织形态、滋气味等感官指标进行评价，评分低于60分表示不能被消费者接受，评价标准详见表2；腐烂指数的测定：参照杨燕婷等[25]方法，按公式(1)计算，腐烂指数等级划分如表3所示。

表2 感官评价评分表Table 2 Sensory Evaluation Scale

表3 腐烂指数等级划分表Table 3 Rating index ranking table

(1)

1.4 数据分析

以上试验均重复3次，采用Excel 2010绘图；响应面优化采用Design-Expert 8.0.6软件进行二次回归分析及方差分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

双孢蘑菇采摘后，极易发生褐变。褐变不仅影响外观品质，还会降低双孢蘑菇的营养和食用价值[3,26]，本研究以褐变度为检测指标进行单因素试验。

研究表明，第1～15天，不同体积分数的蜂胶溶液、蜂蜡溶液和吐温80均可降低双孢蘑菇的褐变度，蜂胶溶液体积分数为1.5%时，蜂蜡溶液、吐温80的体积分数均为2%时，双孢蘑菇褐变度最低。第15天的褐变度随蜂胶溶液的浓度变化如图1-A所示，当蜂胶溶液为1.5%时，双孢蘑菇褐变度最低为0.75。第15天的褐变度随蜂蜡溶液及吐温80的浓度变化如图1-B所示，当蜂蜡溶液、吐温80为2%时，双孢蘑菇褐变度均最低，分别为为0.72、0.83。

图1 不同体积分数的蜂胶溶液、蜂蜡溶液和吐温80对双孢蘑菇褐变度的影响Fig.1 Effect of udume fraction of propolis solution, bees wax solution and Tween 80 on browning degree of A.bisporus

2.2 Box-Behnken中心组合设计试验结果

在单因素试验基础上，以蜂胶溶液、蜂蜡溶液、吐温80三个因素对双孢蘑菇贮藏期褐变度的影响，采用3因素3水平的响应面分析法。按照表4中的Box-Behnken试验方案进行试验，各组褐变度见表4。

表4 复合涂膜剂试验设计及结果Table 4 Test design and results of composite coating agent

复合涂膜剂二次回归方程：褐变度=0.28+0.014×X1-0.018×X2-8.875E-003×X3+

表5 复合涂膜剂试验二次回归方程模型方差分析Table 5 Variance analysis of quadratic regression equation model for composite coating agent test

注：**P<0.01，差异极显著；*P<0.05，差异显著。

由图2可知，蜂蜡溶液对复合涂膜剂配方影响极显著(P<0.01)，而蜂胶溶液对复合涂膜剂配方影响显著(P<0.05)，吐温80对复合涂膜剂影响不显著(P>0.05)。

图2 复合涂膜剂配方的响应面立体分析图Fig.2 A three-dimensional analysis of the response surface of the composite coating agent formulation

蜂蜡溶液与吐温80之间的交互作用显著(P<0.05)， 蜂胶溶液与吐温80交互作用极显著(P<0.01)，F值越大影响越显著，响应面的梯度曲线曲面弯曲程度大，表示影响越显著。各因素对水解度的影响顺序为X2

综合单因素及响应面试验结果，双孢蘑菇复合涂膜剂优化工艺参数为:蜂胶溶液1.39%，蜂蜡溶液2.04%， 吐温80 2.01%，褐变度预测值为0.28，验证(n=6)后试验值为0.29，相对误差0.01，试验值基本与预测值相符。

2.3 双孢蘑菇的复合涂膜剂保鲜试验

2.3.1 复合涂膜剂对双孢蘑菇感官评价的影响

利用蜂胶、蜂蜡复合涂膜剂保鲜双孢蘑菇，并进行感官评价(图3)。结果发现，随着贮藏时间的延长，双孢蘑菇感官评分均呈下降趋势，对照与处理之间差异显著(P<0.05)。对照组在第15天时感官评分下降至57分(表6)，子实体出现开伞、褐变现象，但经复合涂膜剂处理后的子实体在第15天时感官评分值仍为68.89分，相比于CK，处理组的感官评分提高了20.86%，且子实体感官品质维持良好。

图3 复合涂膜剂处理对双孢蘑菇感官品质的影响Fig.3 Influence of compound coating agent on sensory quality of A. bisporus注：图片描述第1行均为CK，第2行为处理组，其余下同。

表6 复合涂膜剂处理前后的双孢蘑菇感官评分对比Table 6 Comparison of sensory scores of A.bisporus before and after treatment with compound coating agent

2.3.2 复合涂膜剂对双孢蘑菇失重率、硬度的影响

由图4可知，随着贮藏时间的延长，CK和处理组的失重率均呈上升趋势，硬度则均呈下降趋势。处理组的失重率均显著低于CK，而硬度均显著高于CK(P<0.05)。第15天时，CK、处理组失重率分别为16.00%、12.00%，硬度分别为4.00、6.45 MPa，相比于处理组，CK失重率增加了4.00%，硬度降低了37.98%。本试验中，双孢蘑菇的失重率与硬度呈负相关关系，复合涂膜剂处理可延缓双孢蘑菇的失重率升高及硬度的下降。

图4 复合涂膜剂对双孢蘑菇失重率与硬度的影响Fig.4 Effect of composite coating agent on weight loss rate and hardness of A.bisporus

2.3.3 复合涂膜剂对双孢蘑菇呼吸强度的影响

由图5可知，CK和处理组的呼吸强度均呈先升后降的变化趋势。处理组与CK均在第3 d达到呼吸高峰，呼吸高峰值分别为101.00和107.78 mg/(kg·h)，处理组的呼吸高峰值比CK降低了6.29%。第3天后，处理组呼吸强度均显著低于CK(P<0.05)。复合涂膜剂降低了贮藏期间双孢蘑菇的呼吸强度。

图5 复合涂膜剂对双孢蘑菇呼吸强度的影响Fig.5 Effect of composite coating agent on respiratory intensity of A. bisporus

2.3.4 复合涂膜剂对双孢蘑菇可溶性蛋白含量的影响

由图6可知，随着贮藏时间的延长，CK和处理组的可溶性蛋白含量均呈下降趋势。第6天后，处理组可溶性蛋白含量均显著高于CK(P<0.05)。第15天时，处理组的可溶性蛋白含量(3.94 mg/g)比CK(3.27 mg/g)高20.49%。复合涂膜剂可有效抑制贮藏期双孢蘑菇可溶性蛋白含量的降低。

图6 复合涂膜剂对双孢蘑菇可溶性蛋白含量的影响Fig.6 Effect of composite coating agent on soluble protein content of A. bisporus

2.3.5 复合涂膜剂对双孢蘑菇MDA含量的影响

由图7可知，随着贮藏时间的延长，CK和处理组的MDA含量均呈上升趋势。第6天后，处理组MDA含量均显著低于CK(P<0.05)。第15天时，处理组的MDA含量(1.24 mmoL/g)低于CK(1.45 mmoL/g)14.48%。 结果表明，复合保鲜剂能够有效抑制双孢蘑菇在贮藏过程中的细胞膜脂的过氧化，减少了MDA的积累，可对细胞膜结构有一定保护作用。

图7 复合涂膜剂对双孢蘑菇MDA的影响Fig.7 Effect of composite coating agent on MDA in A.bisporus

2.3.6 复合涂膜剂对双孢蘑菇菌落总数与腐烂指数的影响

由图8可知，随着贮藏时间的延长，CK和处理组的菌落总数与腐烂指数均呈上升趋势，处理组的菌落总数与腐烂指数均显著低于CK(P<0.05)。第15天时，处理组的菌落总数(7.40 CFU/g)较CK(8.87 CFU/g)低16.57%；处理组的腐烂指数为11.00%，相比于CK(14.70%)，降低了3.70%。复合涂膜剂处理可显著抑制双孢蘑菇贮藏期间的微生物侵染，降低其表面菌落总数。

图8 复合涂膜剂对双孢蘑菇菌落总数与腐烂指数的影响Fig.8 Effect of composite coating agent on the total number of colonies and decay rate of A.bisporus

2.3.7 复合涂膜剂对双孢蘑菇体内POD、CAT、SOD、PPO酶活性影响

由图9可知，CK和处理组的POD、CAT和SOD活性均随贮藏时间的延长呈现先升高后下降的趋势，而PPO随着贮藏时间的延长呈下降趋势。第9天时，处理组的POD、CAT、SOD活性出现高峰，值为0.13、 0.28、1.20 U/g，分别比CK(0.08、0.2、0.98 U/g)高出62.50%、40.00%、22.45%(图9-A～图9-C)。在第3天后，PPO活性均显著低于CK(P<0.05)。第15天，处理组PPO活性为74.00 U/g，较CK(85.00 U/g)低12.94%(图9-D)。复合涂膜剂在一定程度延缓了贮藏期间双孢蘑菇体内POD、CAT、SOD活性的降低，抑制了其PPO活性的升高，有利于延长双孢蘑菇耐贮性。

图9 复合涂膜剂对双孢蘑菇POD、CAT、SOD、PPO活性影响Fig.9 Effect of composite coating agent on POD, CAT, SOD and PPO activities of A. bisporus

3 讨论

蜂胶中含有大量的黄酮、酚酸类、萜烯类等物质，这些酚类物质可成为自由基终止剂、金属螯合剂和单线态氧淬灭剂，进而提升农产品的自身抗氧化能力，减弱组织损伤、酶促褐变[12-13,27]。且这些非离子化的亲脂性分子可以渗入到微生物细胞膜内，破坏膜传递过程，并在细胞内解离而增加酸性，改变体系pH，增强抑菌效果[25-26]。蜂蜡是一种具有疏水性的天然脂类物质，能在果蔬表面形成一层透明薄膜，膜中的微孔通道可调节果实微环境气体成分，使得其体内出现低氧环境，延长储藏期[15-16,28]。蜂胶、蜂蜡复合涂膜剂具有良好的保鲜及抑菌效果，是开发天然、绿色保鲜剂的绝好材料。

双孢蘑菇采后品质变化主要为失重和褐变。失重现象主要与失水和营养物质代谢相关[29]。褐变主要是由体内的PPO引起，PPO通过将酚类物质氧化为醌，进一步产生黑色素，从而导致蘑菇褐变[30]。本研究表明，复合涂膜剂能有效抑制双孢蘑菇在贮藏期间的品质劣变(图3、表6)、失重率(图4)和可溶性蛋白消耗(图6)，降低了呼吸强度(图5)和褐变程度(图7)。这可能与复合涂膜剂中蜂蜡有关，蜂蜡成膜后可阻止菇体内部的水分迁移，减少质量损失和营养成分的消耗，延长贮藏期[28]。POD、CAT、SOD是植物体内主要的活性氧清除剂，对抑制果蔬酶促褐变有极其重要的作用[31]。本研究表明，处理组POD、CAT、SOD的活性均高于CK(图9-A～图9-C)，而PPO的活性低于CK(图9-D)，这可能是由于蜂蜡的阻隔作用，抑制了活性氧的产生；加上蜂胶中的黄酮、酚酸类物质共同作用使得处理组菇体内的POD、SOD、CAT活力升高，延缓氧化酶促褐变[12,27]。处理组PPO活性降低，可能是被蜂胶中金属螯合离子、黄酮、酚酸类等物质所抑制[13]。蜂胶中的亲脂性分子可以抑菌，使得本研究中处理组的微生物菌落数显著低于CK(图8)，这与曹红刚等[19]研究相一致。

双孢蘑菇是呼吸跃变型果实，采摘之后仍然进行呼吸作用和代谢活动，导致菌柄伸长、菌盖开伞、菌体皱缩软化等[4]。机械损伤和微生物侵染也会引起组织发生褐变、甚至腐烂变质，缩短了货架期，降低食用和商品价值[32]。因此双孢蘑菇的采后贮藏保鲜技术研究尤为重要。保鲜剂不仅能够抑制腐败微生物的侵染，还能降低食用菌采后呼吸作用。常用的化学保鲜剂如CaCl2、VC、焦亚硫酸钠、柠檬酸、聚乙烯醇等，但易产生二次污染和残毒等问题[33]。天然保鲜剂开发将是食用菌保鲜剂的发展方向。天然提取物如壳聚糖[34]、肉桂精油[35]和中草药[36]等近年来常应用于食用菌保鲜，本实验以蜂胶、蜂蜡作为主要材料，复合涂膜保鲜双孢蘑菇，取得较好的保鲜效果。所用材料为蜜蜂产业的副产品，均为天然成分，绿色环保、且具可食用性。本研究为双孢蘑菇保鲜提供一种新方法，也为可食性蜂胶蜂蜡复合涂膜剂的应用提供新思路。

4 结论

本研究利用响应面试验设计优化蜂胶蜂蜡复合涂膜剂配方，并用最优复合比例进行双孢蘑菇保鲜试验。结果表明，复合涂膜剂最优配比为蜂胶溶液1.39%、蜂蜡溶液2.04%、吐温80 2.01%。双孢蘑菇经复合涂膜剂保鲜处理后，与CK相比，双孢蘑菇贮藏期间的品质劣变、失重率、腐烂率、菌落总数、呼吸强度、MDA含量、PPO活性均显著降低，菇体硬度、可溶性蛋白含量、POD、CAT、SOD活性均显著升高。蜂胶蜂蜡复合涂膜剂能较好地保持双孢蘑菇的感官品质和营养价值，有效延长贮藏时间。本研究提供了一种适合双孢蘑菇的可食性涂膜保鲜方法。