心康冲剂改善慢性心衰模型大鼠心肌凋亡及调控Caspase-3/9的表达

2019-09-10 07:22刘蓉芳毛以林谭雄张辉毛湘屏杨柳陈志成
湖南中医药大学学报 2019年8期
关键词:冲剂心肌细胞心衰

刘蓉芳 毛以林 谭雄 张辉 毛湘屏 杨柳 陈志成

〔摘要〕 目的 探讨心康冲剂对心衰大鼠Caspase-3、Caspase-9表达的调控作用。方法 58只SD大鼠分为正常组10只,模型组、心康组及对照组各16只,造模完后,心康组给予心康冲剂溶液0.5 g/kg灌服,对照组予芪苈强心胶囊溶液0.06 g/kg灌服。采用心脏彩超检测心功能;心脏切片行TUNNEL染色法观察心肌细胞凋亡;心肌组织采用Real-time PCR法及免疫组化法检测Caspase-3、Caspase-9基因及蛋白质表达。结果 与正常组比,模型组大鼠Caspase-3及Caspase-9的mRNA与蛋白表达显著增加(P<0.01),TUNNEL染色观察细胞凋亡明显增多;与模型组比较,心康组大鼠心肌凋亡减轻, Caspase-9 mRNA、Caspase-3 mRNA及蛋白明显下降(P<0.01);与对照组相比,心康组心肌细胞凋亡相对降低,Caspase-3蛋白表达下降(P<0.05)。结论 心康冲剂可调控下调Caspase-3、Caspase-9表达抗心衰。

〔关键词〕 心肌凋亡;Caspase-3;Caspase-9;慢性心衰;心康冲剂

〔中图分类号〕R285.5;R541.6       〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi:10.3969/j.issn.1674-070X.2019.08.004

〔Abstract〕 Objective To investigate the regulatory effects of Xinkang Granule (XKG) on the rats with chronic heart failure (CHF) for the expression of Caspase-3 and Caspase-9. Methods A total of 58 SD rats were randomly divided into a normal group (n=10), a model group, a XKG group, and a control group, with 16 rats in each group. After the success of the modeling, the XKG group was given XKG solution at 0.5 g/kg, and the control group was given Qili Qiangxin Capsule (QLQXC) solution at 0.06 g/kg. Cardiac function was measured by echocardiography; Heart slices were stained by TUNNEL to observe myocardial apoptosis. The expression of gene and protein of Caspase-3, Caspase-9 were detected by Real-time PCR and immunohistochemistry. Results Compared with the normal group, the gene and protein of Caspase-3, Caspase-9 in the model group significantly increased (P<0.01). TUNNEL observed significant increase of apoptosis. Compared with the model group, the rats in XKG group showed alleviated myocardial apoptosis, and the Caspase-3, Caspase-9 mRNA and protein expression were significantly reduced (P<0.01). Compared with the control group, the myocardial apoptosis in the XKG group was relatively decreased, and Caspase-3 decreased (P<0.05). Conclusion XKG has the function of anti-heart failure by regulating and controlling the expression of Caspase-3 and Caspase-9.

〔Keywords〕 myocardial fibrosis; Caspase-3; Caspase-9; chronic heart failure; Xinkang Granule

多種病理因素(如肾上腺素、血管紧张素Ⅱ、氧化应激、致炎细胞因子、缺血、压力或容量负荷过重、缺氧等)均可使慢性心力衰竭(CHF)诱导出现心肌细胞凋亡[1-2]。心肌凋亡是心衰心脏重构(cardiac remodeling, CR)表现形式之一。由半胱胺酸天冬氨酸酶(Caspases)家族蛋白介导的心肌凋亡途径是内源性凋亡途径,Caspase-3是细胞凋亡的标志[3],处于凋亡级联上游,传递信号给下游的Caspase-9从而启动凋亡程序,Caspase-3/-9是经典凋亡通路中的两个关键蛋白。

ARB、ACEI类药物是临床抗心肌重构药物,由于其相对适应症、禁忌症导致药物使用有一定局限性,因而探讨安全有效的抗心肌凋亡中药显得尤为迫切。心康冲剂具有健脾渗湿、温阳化气逐水饮的功效,前期研究显示其具有抗慢性心力衰竭[4],并能改善心肌重构[5-6]。本研究观察心康冲剂调控慢性心力衰竭大鼠Caspase-3、Caspase-9表达,探讨其对慢性心力衰竭大鼠抗心肌凋亡的作用,为治疗心衰提供了新的途径。

1 材料与仪器

1.1  实验动物

58只SPF级SD大鼠,雌雄各半,5周龄,体质量(160±20) g,购于湖南斯克达实验动物有限公司(实验动物合格证号:43004700025096)。

1.2  药品及仪器

盐酸阿霉素(深圳万乐药业),末端脱氧核苷酸转移酶(TdT,上海江莱生物);actin(1∶4 000,Mouse,美国proteintech),二抗HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)(美国proteintech),HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) (美国proteintech),Caspase-3(1∶1 000,Rabbit,美国CST),Caspase-9(1∶200,Rabbit,美国proteintech),TUNNL试剂盒(武汉博士德生物公司),免疫组化二抗试剂盒 PV-9000(北京中杉金桥生物公司),引物(上海生工合成),心康冲剂(湖南省中医院中药制剂室制备)。动物用彩色多普勒超声仪(徐州市大为电子设备有限公司),生物信号采集系统(成都泰盟软件有限公司),LEICA DM LB2型双目显微镜(德国

LEICA),Motic B5显微摄像图像分析系统(麦克奥迪实业集团),BX43型双目生物摄像显微镜(日本Olympus)。

2 方法

2.1  动物分组及造模

取大鼠10只为正常组,余下大鼠48只按1.5 mg/kg剂量腹腔注射阿霉素,每周2次,共注射7周,以左心室短轴缩短率<30%[7]为心衰造模成功,造模方法参考文献[8];再按随机数字表法分为阿霉素对照组(模型组)16只,心康冲剂1倍等效剂量组16只(心康组),芪苈强心胶囊组(对照组)16只。

2.2  药物制备及干预

心康冲剂溶液配制:白参10 g,薏苡仁30 g,大腹皮10 g,黄芪30 g,桔梗5 g,升麻5 g,柴胡5 g,桂枝10 g,茯苓15 g,生姜皮10 g,陈皮10 g,炒白术10 g,制附片10 g,砂仁6 g。经湖南省中医院药剂科制成干燥颗粒后,按成人等效剂量0.5 g/kg配制成浓度为0.6 g/mL的溶液;对照组给予芪苈强心胶囊溶液,按成人等效剂量(0.06 g/kg),配制为浓度0.073 g/mL。大鼠灌胃剂量按人和动物体表面积折算[9],正常组、模型组予等体积生理盐水灌服,每日1次,连续8周。

2.3  指标及检测方法

2.3.1  心脏超声检测心功能  10%水合氯醛溶液按3 mL/kg麻醉大鼠后前胸脱毛,超声诊断仪取大鼠左心室长轴切面后进行M超声检测,测量左心室短轴缩短率(LVFS)、左室舒张期内径(LVIDd)、左室射血分数(LVEF),所有数据均测量3次并取其平均值记录。

2.3.2  TUNNEL染色法检测细胞凋亡  投入10%多聚甲醛溶液固定的大鼠心脏,先后经石蜡包埋、切片、透明、脱水、PBS漂洗后,50 μL TdT+450 μL荧光素标记后反应10 min。再加50 μL TUNEL反应混合液,PBS漂洗、DAPI染色,封片,观察细胞凋亡情况。

2.3.3  Real-time PCR法检测心肌Caspase-3 mRNA、Caspase-9 mRNA表达  Trizol法提取大鼠心脏组织总RNA,再行RNA的琼脂糖凝胶电泳。取大鼠左心室心尖部分2 μg,逆转录cDNA,42 ℃孵育15 min,85 ℃孵育5 min离心,冰上冷却,行定量PCR反应。每个样本每个指标3个孔,每孔10 μL。定量PCR扩增条件:95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,40个循环。以2-ΔΔCt反映各样品相对于对照组样品目的基因的表达水平。-ΔΔCt=ΔCt对照组-ΔCt样品,△Ct=△Ct目的-△Ct内参。每个样本重复3次,然后进行统计分析。

在NCBI上搜索获得Caspase-3、Caspase-9基因序列,primer5设计引物,上海生工合成。引物序列见表1。

2.3.4  免疫组化法检测心肌Caspase-3、Caspase-9含量  心肌标本均经4%多聚甲醛液固定、包埋、切片、脱蜡、乙醇脱水后,3%双氧水阻断内源性过氧化物酶;微波修复抗原2次,冷至室温,PBS洗,加1∶100一抗Caspase-3、Caspase-9每片50 μL,4 ℃過夜,加二抗,滴加二甲基联苯胺(DAB)显色液,苏木精复染、脱水、透明、封片。采用MOTIC图像分析系统在×400倍光学显微镜下对Caspase-3、Caspase-9阳性结果进行半定量分析;分析每个视野下各细胞光密度值,最后取该切片总的平均密度值。

平均光密度值=积分光密度值/所选定视野总面积

2.4  统计学方法

所有数据应用SPSS 20.0统计软件进行处理。全部计量资料用“x±s”表示,先检验正态性,如满足正态性,采用单因素方差分析;两两比较,方差齐采用方差分析-LSD检验,方差不齐用Games-Howell 检验;不满足正态性时选择秩和检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1  各组大鼠心脏超声结果比较

与正常组比较,模型组心脏扩大而收缩力下降,表现为LVIDd增大,而LVFS、LVEF下降(P<0.01);与模型组比较,对照组及心康组心腔变小而收缩力增强,LVIDd缩小,LVEF、LVFS升高(P<0.05,P<0.01);与对照组比较,心康组LVEF升高(P<0.05)。见表2。

3.2  TUNNEL法观察细胞凋亡

400×光镜下观察:正常组细胞核排列规整、呈蓝色长梭形。造模后,模型组棕褐色坏死颗粒物质明显增多;与模型组相比,心康组棕褐色坏死颗粒物质则明显减少;与对照组相比,心康组心肌细胞凋亡相对较少。见图1。

3.3  Caspase-3 mRNA、Caspase-9 mRNA比较

模型组与正常组比,Caspase-3、Caspase-9基因表达显著增加(P<0.01),表明凋亡基因增多;心康冲剂干预后,心康组Caspase-3、Caspase-9基因表达显著下降(P<0.01);与对照组比,心康组Caspase-3、Caspase-9基因表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

3.4  Caspase-3、Caspase-9蛋白表达比较

与正常组比,模型组凋亡蛋白表达增多,Caspase-3、Caspase-9蛋白表达显著增加(P<0.01);经心康冲剂、芪苈强心胶囊干预后,心康组及对照组Caspase-3、Caspase-9蛋白表达显著下降(P<0.01);与对照组比,心康组caspase-3表达显著下降(P<0.05)。见表4、图2-3。

4 讨论

中医学将慢性心力衰竭类归于“水肿”“喘证”“心悸”等范畴。中医药治疗慢性心力衰竭疗效肯定,研究证明,芪苈强心胶囊有抗大鼠心肌细胞凋亡作用[10-11]。心康冲剂以真武汤、升陷汤及参苓白术散为基础方,具有健脾渗湿、温阳化气逐水饮功效,能有效治疗慢性心衰水肿、喘证、心悸等水湿内停之证[4]。

细胞凋亡发病机制主要有死亡受体通路、线粒体通路、内质网通路3条途径。其中由多种生物、理化刺激信号触发形成凋亡体,激活Caspase-9,从而剪切并激活下游的Caspase-3导致细胞凋亡,是内源性途径机制。Caspases介导心肌细胞凋亡并参与慢性心力衰竭的发生、发展[12-13]。Caspase-3是凋亡级联反应最关键的凋亡蛋白酶[14]。

本实验中,模型组心肌凋亡明显增多,LVIDd明显升高,而LVFS、LVEF显著下降,同时Caspase-3及Caspase-9的核酸及蛋白表达增加,表明凋亡组织中具有Caspase-3、Caspase-9表达增加的特征。心康冲剂干预后,心肌凋亡减轻,LVIDd明显下降,

LVEF、LVFS明显升高,表明心康冲剂具有缩小扩大的心脏、增强心肌收缩力、提升射血功能。与对照组比,心康冲剂组使心脏缩小、心功能提高更明显,并且下调Caspase-3蛋白表达更明显,而Caspase-3

mRNA表达无差异,表明心康冲剂调控Caspase-3的mRNA与蛋白表达呈非一致性,说明在调控Caspase-3的mRNA与蛋白表达中有其他因素参与;因此,临床实践及动物实验表明,心康冲剂具有良好的抗心衰竭及抗心肌凋亡作用,临床值得推广应用。

参考文献

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