份甘蔗种质的遗传多样性分析及DNA指纹图谱构建

庞新华 檀小辉 韦丽君 梁芳 张继 吕平 程琴 黄秋伟 周全光

摘要：【目的】利用SRAP分子標记分析35份甘蔗种质的遗传多样性，并构建其DNA指纹图谱，为甘蔗种质资源的分子鉴定提供技术支持。【方法】以凉蔗系列（26份）为主的35个甘蔗品种（系）为供试材料，利用SRAP分子标记的8条正向引物和14条反向引物随机组成112对引物组合，从中筛选出核心引物对35份甘蔗材料进行遗传多样性分析，并利用POPGENE 1.32计算各材料间的Nei’s遗传相似系数，使用Ntsyspc 2.1 UPGMA方法进行聚类分析，并构建DNA指纹图谱。【结果】从112对引物组合中筛选出4对核心引物组合（Me3/Em8、Me4/Em8、Me5/Em8和Me6/Em2），利用其从35份甘蔗材料中共扩增出102条条带，平均每对引物的扩增条带数、多态性条带数和多态性比率分别为25.5条、21条和81.20%，各引物组合扩增的条带数为21～30条，多态性比率为61.90%～96.55%。根据Nei’s遗传相似系数，在遗传相似系数为0.751时，可将35份甘蔗材料分为五大类，26个凉蔗系列品种（系）（除凉蔗07-54外）均归在I类和II类，说明凉蔗系列的亲缘关系较近;桂糖73-167和农垦2号分别被单独归为一类，说明这两个品种（系）间及与其他品种（系）间的亲缘关系较远;I类中除凉蔗系列之外，还包括粤糖91-976和ROC16，说明这两个品种（系）有可能是I类中凉蔗系列的杂交亲本或存在血缘关系;II类中除凉蔗系列外，还包括B8、ROC22、ROC24和ROC10，说明这4个品种（系）的亲缘关系较近，ROC系列可能存在II类中凉蔗系列的亲本。利用这4对核心引物组合构建的DNA指纹图谱均可将35份甘蔗材料鉴别开。【结论】35份甘蔗材料的遗传多样性丰富，构建的DNA指纹图谱可用于甘蔗品种（系）鉴定。

关键词： 甘蔗;SRAP分子标记;遗传多样性;DNA指纹图谱

中图分类号： S566.102.4                             文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）06-1157-08

Abstract：【Objective】The genetic diversity of 35 sugarcane germplasm resources was analyzed by SRAP molecular marker， and 35 fingerprints of sugarcane germplasm were constructed to provide technical support for molecular identification of sugarcane germplasm resources. 【Method】The 35 sugarcane varieties（lines） from Liangzhe series（26 varieties） were used as materials. A total of 112 primer pairs which were randomly formed by 8 forward primers and 14 reverse pri-mers of SRAP molecular markers were obtained. Core primers were selected from the above primers to  analyze the genetic diversity of 35 sugarcane materials， and POPGENE 1.32 was used to calculate the Nei’s genetic similarity coefficient between the tested varieties. Cluster analysis was performed using Ntsyspc 2.1 UPGMA method， and DNA fingerprint map was constructed. 【Result】A total of 102 bands were amplified from 35 tested sugarcane materials by the four pairs of core primer combinations（Me3/Em8， Me4/Em8， Me5/Em8 and Me6/Em2） selected from 112 pairs of primers. The average amplified bands per pair of primers was 25.5， polymorphic bands were 21 and average percentage of polymorphic bands per pair of primers was 81.20%. The bands amplified of each combination ranged from 21 to 30， percentage of polymorphism was 61.90%-96.55%. According to Nei’s genetic similarity coefficient， when the genetic similarity coefficient was 0.751， the sugarcane germplasms could be divided into five categories. Among the 26 Liangzhe series varieties（lines）， apart from Liangzhe 07-54， the rest materials were in category I or category II. It indicated that the genetic relationship of Liangzhe series were close. Guitang 73-167 and Nongken 2 were in each category by their own， indicating these two varie-ties（lines） had far genetic relationship with others. In category I， besides Liangzhe series， there were Yuetang 91-976 and ROC16， which showed that the two varieties might be hybrid parents of Liangzhe series in this category or had gene-tic relationship. In category II， besides Liangzhe series， there were B8， ROC22， ROC24 and ROC10， indicating the four varieties（lines） had close relationship，  and there might be parents of Liangzhe series in ROC series. The DNA fingerprint map by the four core primer combinations could identified the 35 sugarcane materials. 【Conclusion】The genetic diversity of 35 sugarcane germplasms is rich， and the construction of DNA fingerprint map provides a theoretical basis for the identification of sugarcane varieties（lines）.

Key words： sugarcane; SRAP molecular marker; genetic diversity; DNA fingerprint map

0 引言

【研究意义】我国甘蔗育种工作始于20世纪50年代，目前已选育出大量高产、高糖等品质优良的新品种（系）（邓海华和张琼，2006;王泽平等，2012）。甘蔗种质遗传多样性越来越丰富，仅靠表型性状对品种进行准确鉴定，难度很大。已有研究发现，利用分子标记技术可有效分析甘蔗种质的遗传多样性及快速准确地鉴定品种特性，从而对甘蔗种质资源进行有效保护（刘新龙等，2010;朱专为，2018）。其中，SRAP分子标记具有重复性好、多态性高、操作简单等优点，已广泛用于遗传多样性分析、遗传图谱构建、亲缘关系鉴定等（Li and Quiros，2001;廖诗童等，2012;石悦等，2018;石秀兰等，2018;周兆禧等，2018）。因此，利用SRAP分子标记进行甘蔗品种（品系）的遗传多样性分析及其指纹数据图谱构建，对甘蔗种质的保存保护、鉴定和创新利用具有重要意义。【前人研究进展】目前，利用SRAP分子标记进行植物遗传多样性分析的研究已有大量报道。班骞等（2018）利用SSR和SRAP分子标记构建14个苦荬菜品种（系）的DNA指纹图谱，结果表明，苦荬菜的遗传多样性较丰富，构建的DNA指纹图谱可区分供试各品种（系）。陈倩倩等（2018）利用SRAP和EST-SSR分子标记对10份香椿种质进行遗传多样性分析，结果表明，在遗传相似系数0.85774时10份香椿分为三大类，遗传多样性较丰富。李永平等（2018）利用SRAP分子标记对44个芥菜品种进行遗传多样性分析，结果表明，在遗传相似系数为0.67时可将其分为四大类，聚类结果与形态学分类结果相吻合。王晓燚等（2018）利用SRAP和SSR分子标记构建了2个杏扁品种龙王帽和优一的分子连锁图，获得132个SRAP分子标记和17个SSR分子标记，构建了两个亲本的遗传连锁图谱。王少铭等（2018）利用SRAP和ISSR分子标记进行48份薄荷种质的遗传多样性及亲缘关系分析，结果表明，薄荷种质的遗传多样性丰富，但种内遗传变异较小;在遗传相似系数为0.73处，48份薄荷种质分为五大类，主要由品种差异决定，受地域影响较小，与形态标记分类相吻合。曾绍贵等（2018）将形态指标和SRAP分子标记相结合对地理来源不同的100份朝天椒种质进行遗传多样性分析，结果表明，SRAP聚类结果与品种地理来源相吻合，地理来源相邻的品种遗传多样性相似。朱静娴等（2018）利用SRAP分子标记对国内外的大球盖菇菌株进行遗传多样性分析，结果表明，在遗传相似系数为0.84处，23株菌株可分为三大类群，遗传多样性丰富，利用SRAP分子标记能鉴别区分各菌株，并得出菌株间亲缘关系。周兆禧等（2018）研究发现，只有通过SRAP和ISSR分子标记才能鉴别区分69份红毛丹种质，并利用筛选出的引物成功构建乐红毛丹种质的DNA指纹图谱。但利用SRAP分子标记对甘蔗种质遗传多样性分析的研究较少，廖诗童等（2012）利用SRAP分子标记对35个不同耐寒甘蔗品种的的遗传多样性进行分析，结果发现SRAP分子标记对耐寒性较差的甘蔗品种（系）聚类效果较好。吕平等（2016）将巴西甘蔗DNA导入桂热甘蔗03-75品系，利用SRAP分子标记分析发现受体甘蔗03-75中带有供体甘蔗的特异条带。【本研究切入点】至今，鲜见基于SRAP分子标记进行甘蔗遗传多样性分析、DNA指纹图谱构建及种质鉴定等方面的研究报道。【拟解决的关键问题】以凉蔗系列品种（系）为主的35份甘蔗种质为材料，采用SRAP分子标记探讨其遗传多样性及亲缘关系，并构建DNA指纹图谱，为参试甘蔗品种（系）的鉴定、保护及开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试材料为35个甘蔗品种（系），包括26个凉蔗系列品种（系），4个新台糖系列品种（系），5个其他品种（系）（表1），均由广西亚热带作物研究所广西农垦甘蔗研究所甘蔗种质圃保存提供。正、反向引物（Li and Quiros，2001）（表2）委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。主要试剂：SDS、氯仿、异戊醇等生化试剂及DNA Marker、MIX酶等分子试剂均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。主要仪器设备：GEL DOCXR全自动凝胶成像系统（BIO-RAD，美国）、PCR仪（BIO-RAD，美国）、Smart SpecTM Plus核酸蛋白含量测定仪（BIO-RAD，美国）和DYY-6C双稳定定时电泳仪（北京六一仪器厂）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 样品采集 在甘蔗生长旺盛期分别剪取植株顶端的心叶放入自封袋，置入液氮浸泡5 min后取出，迅速放入-80 ℃保存备用。

1. 2. 2 甘蔗基因组DNA提取 采取改良的SDS法提取样品基因组总DNA，用分光光度计测定DNA的浓度和纯度，然后用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，-80 ℃保存备用。

1. 2. 2 SRAP-PCR扩增及引物筛选 利用正、反向引物随机组成112对引物组合（表2）。反应体系：2×Taq Mix 12.5 µL，10 ng/µL DNA模板2.0 µL，10 µmol/L正、反向引物各0.5 µL，ddH2O补足至25.0 µL。扩增程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 1 min，35 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，进行5個循环;94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，进行30个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测（120 V恒压电泳30 min），EB染色后观察电泳图谱，从112对引物组合中筛选出多态性较高、条带清晰且稳定的引物组合，再用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测（180 V恒压电泳55 min），银染后拍照进一步筛选核心引物组合。

1. 3 统计分析

观察电泳图谱，在同一迁移位置上，有扩增条带记为“1”，无条带记为“0”，从而构成“0，1”矩阵。利用POPGENE 1.32计算甘蔗种质间的Nei’s遗传相似系数，利用Ntsyspc 2.1的UPGMA方法构建聚类图。根据聚类结果，筛选出可鉴别甘蔗品种（系）的引物组合，再根据该引物组合的“0，1”矩阵，手动构建DNA指纹图谱。

2 结果与分析

2. 1 SRAP引物的多态性分析结果

对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检測，结果从112对引物组合中筛选出多态性高、条带清晰且稳定的引物组合13对。图1为部分引物组合PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果。再经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测从13对引物组合中筛选出多态性、条带数、稳定性等综合表现均较好的核心引物组合4对，分别为Me3/Em8、Me4/Em8、Me5/Em8和Me6/Em2，用于遗传多样性分析及DNA指纹图谱构建。图2为核心引物组合Me4/Em8 PCR产物的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。

由表3可知，4对核心引物组合从35份供试甘蔗材料中共扩增出102条条带，平均每对引物的扩增条带数、多态性条带数和多态性比率分别为25.5条、21条和81.20%，表明甘蔗种质的遗传多样性较丰富、多态性较高。各引物组合扩增的条带数为21～30条，其中Me4/Em8引物组合扩增的条带数最多，为30条，Me3/Em8引物组合扩增的条带最少，为21条。各引物组合扩增出的多态性条带数为13～28条，其中Me5/Em8引物组合扩增的多态性条带数最多，为28条，Me3/Em8引物组合扩增的多态性条带数最少，为13条。各引物组合扩增的多态性比率为61.90%～96.55%，其中Me5/Em8引物组合的多态性比率最高，为96.55%，Me3/Em8引物组合的多态性比率最低，为61.90%。

2. 2 聚类分析结果

根据Nei’s遗传相似系数，采用UPGMA方法对35份供试甘蔗材料进行聚类分析，结果如图3所示。从图3可看出，在遗传相似系数为0.751时，可将35份甘蔗材料分为五大类：I类包含18份甘蔗材料，分别为凉蔗01-96、凉蔗01-123、凉蔗02-7、凉蔗02-188、凉蔗01-190、粤糖91-976、凉蔗03-7、凉蔗03-31、凉蔗03-81、凉蔗03-83、凉蔗01-204、ROC16、凉蔗02-6、凉蔗02-186、凉蔗03-23、凉蔗02-183、凉蔗05-4和凉蔗2号;II类包含13份甘蔗材料，分别为凉蔗03-75、凉蔗05-36、凉蔗07-34、凉蔗05-58、凉蔗07-48、凉蔗07-36、凉蔗07-53、B8、ROC22、ROC24、凉蔗07-45、凉蔗07-49和ROC10;III类包含2份甘蔗材料，分别为凉蔗07-54和福农39;IV类仅含1份甘蔗材料，为桂糖73-167;V类也仅含1份甘蔗材料，为农垦2号。可见，26份凉蔗系列甘蔗种质，除凉蔗07-54外，其余均归在I类和II类，说明凉蔗系列的亲缘关系较近;桂糖73-167和农垦2号分别被单独归为一类，说明这两个品种（系）间及与其他品种（系）间的亲缘关系较远;I类中除凉蔗系列外，还包括粤糖91-976和ROC16，说明这两个品种（系）有可能是I类中凉蔗系列的杂交亲本或存在血缘关系;II类中除凉蔗系列外，还包括B8、ROC22、ROC24和ROC10，说明这4个品种（系）的亲缘关系较近，ROC系列可能存在II类中凉蔗系列的亲本。

2. 3 35份甘蔗材料的指纹图谱构建

将筛选出的4对核心引物组合用于构建35份甘蔗材料的DNA指纹图谱，结果发现这4对核心引物组合均可鉴别所有供试种质。Me5/Em8核心引物组合构建的DNA指纹图谱如图4所示。在品种鉴定时，利用这4对引物组合对待检测的甘蔗材料进行PCR扩增，再经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，最后将该材料的多态性条带与构建的DNA指纹图谱进行对比，即可准确鉴定该材料为本研究供试35份甘蔗材料中的具体品种（系）。因此，构建的DNA指纹图谱可对甘蔗种质发挥一定鉴定和保护作用。

3 讨论

本研究从112对引物组合中筛选出多态性、条带数、稳定性等综合表现较好的4对核心引物组合，平均每对引物扩增的条带数为25.5条，多态性比率为81.20%，与廖诗童等（2012）的研究结果相似，但高于贺尔奇等（2016）在果蔗中用毛细管电泳筛选出的引物多态性比率，其原因可能是琼脂糖凝胶电泳和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳双重筛选出的引物多态性较毛细管电泳筛选得到的引物多态性更丰富，也高于苦荬菜（班骞，2018）、芥菜（李永平等，2018）、薄荷（王少铭等，2018）、酸豆（张永强等，2018）和红毛丹（周兆禧等，2018）等物种SRAP分子标记引物的多态性比率，说明与其他物种相比，SRAP分子标记可能更适合于开展甘蔗的遗传多样性分析和DNA指纹数据图谱构建等相关研究，但仍需进一步验证。

本研究聚类分析结果显示，在遗传相似系数为0.751处可将35份甘蔗材料分为五大类，其中，除凉蔗07-54外，凉蔗系列甘蔗种质归到I类和II类，表明凉蔗系列的亲缘关系较近;除凉蔗系列外，I类中还有粤糖91-976和ROC16，II类中还包括B8、ROC22、ROC24和ROC10，经进一步调查发现，这些品种是部分凉蔗系列品种（系）的杂交亲本，亲缘关系较近，但第III类、第IV类和第V类的甘蔗材料间及与其他品种（系）间的亲缘关系较远。

长期以来，我国农作物种质资源生产尚不规范，主要以植物的外部性状鉴别不同作物品种，尽管简单直观，但不同植物品种在不同环境甚至同一品种在同一环境均可能会表现不同性状，在鉴别时易出现错误，加之一些作物品种间相似度很高，尤其是甘蔗品种（系），有时可能来源于同一杂交亲本，依靠表型特征进行鉴定错误率较高，最终造成引种混乱或品种造假现象经常发生。随着分子生物学的不断发展，越来越多的研究者开始从分子水平研究品种鉴定的方法。从DNA水平上对品种进行鉴定具有快速准确、不受环境影响等诸多优点，DNA指纹图谱技术也应运而生，在植物新品种（系）资源的鉴定上，将农艺性状观测与分子标记技术相结合，可得到更全面、更可靠的结果。SRAP分子标记在作物种质资源鉴定及DNA指纹图谱构建中已得到广泛应用。徐宗大等（2011）、刘君等（2012）、唐源江等（2015）、石秀兰等（2018）、张安世等（2018）分别利用SRAP分子标记构建了玫瑰、狗牙根、国兰、牧草、猕猴桃等植物的DNA指纹图谱，均可对以上植物进行准确地品种鉴定。本研究利用Me4/Em8、Me5/Em8、Me6/Em2和Me3/Em8等4对核心引物组合构建的DNA指纹图谱均可把35份甘蔗材料完全鉴别开，说明这4对核心引物是凉蔗系列鉴别的关键核心引物，可有效分析出其亲缘关系，可用于甘蔗种质的知识产权保护。

4 结论

35份供试甘蔗材料的遗传多样性丰富，构建的DNA指纹图谱可用于甘蔗品种（系）鉴定。

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（責任编辑 陈 燕）