杨树天冬氨酸转氨酶基因家族鉴定及表达分析

王宇晨 曲春浦 刘关君

摘要：【目的】鉴定杨树天冬氨酸转氨酶（ASPAT）基因家族成员，并检测其组织表达特异性，为研究ASPAT在杨树初级氮素同化中的生物学功能提供参考依据。【方法】从杨树基因组数据库中筛选鉴定ASPAT基因家族成员，利用生物信息学软件分析各基因家族成员序列和基因结构及编码蛋白的理化性质、亚细胞定位和保守基序等，并利用实时荧光定量PCR检测正常施氮处理（1 mmol/L NH4NO3）下其在杨树根、茎和叶中的组织表达特异性。【结果】从杨树基因组中共鉴定出9个ASPAT基因家族成员，包括7个真核型ASPAT（AAT）基因（PtASPAT1～PtASPAT7）和2个原核型ASPAT（PAT）基因（PtASPAT8～PtASPAT9），编码区（CDS）序列长度1215～1791 bp，编码的氨基酸数目304～480个，外显子数7～14个，编码蛋白的等电点5.66～8.99，相对分子质量33.11～53.31 kD，脂融指数76.36～93.54，分别定位于叶绿体、线粒体和胞质中，除PtASPAT6和PtASPAT7为不稳定蛋白，其他均为稳定蛋白。拟南芥和杨树的ASPAT蛋白可聚为两大类，Ⅰ类为AAT蛋白，包括PtASPAT1～PtASPAT7和AtASPAT1～AtASPAT5;Ⅱ类为PAT蛋白，包括PtASPAT8、PtASPAT9和拟南芥PAT（AtPAT）。PtASPAT1～PtASPAT6均含有5个保守基序，PtASPAT7缺少2个保守基序，PtASPAT8和PtASPAT9均仅含有1个与AtPAT相同的保守基序。9个杨树ASPAT蛋白均含有磷酸吡哆醛结合位点（SGTHNYSSK）、同源二聚体多肽结合位点（GAVAER）和催化残留活性位点（K）。正常氮素处理下，PtASPAT1基因在杨树根、茎和叶中表达量无明显差异;PtASPAT2～PtASPAT9基因在根部的表达量较在茎和叶中的高，尤其是PtASPAT4和PtASPAT8基因表达量较高。【结论】杨树ASPAT基因家族成员主要在根部表达，尤其是PtASPAT4和PtASPAT8基因在杨树根部的初级氮素同化中发挥重要作用。

关键词： 杨树;天冬氨酸转氨酶（ASPAT）;基因家族;生物信息学;基因表达

中图分类号： S792.119                       文獻标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）03-0506-09

0 引言

【研究意义】氮素是植物生长发育必不可少的元素之一，是生物大分子如蛋白质、核酸及生长激素等的重要组分（于妍等，2008;赵会杰等，2017;杜亚琳等，2018）。我国北方土地干旱、贫瘠，影响着当地林木及农作物的生长发育，严重制约着生态重建和木材供求，目前多采用增施氮肥的方法促进其生长，但易对环境造成不利影响（马文奇等，2006;刘宝林等，2017;李源等，2019）。因此，如何平衡二者关系一直是土壤肥料学科的研究热点。与合理施加氮肥相比，采用分子手段改造植物的氮素利用效率，更加省时省力。天冬氨酸转氨酶（ASPAT）作为初级氮素同化的关键酶，可提高植物氮素利用效率（刘瑞响等，2012;梁成刚等，2013;刘红江等，2017）。本研究对杨树（Populus tomentosa）ASPAT基因家族进行鉴定，明确其生物学功能及表达特性，对提高杨树乃至我国北方林木的氮素利用率具有重要意义。【前人研究进展】天冬氨酸是多种氨基酸及衍生代谢物生物合成的前体，是生命有机体重要的组成成分，由ASPAT催化转氨基反应而合成（Wilkie et al.，1996）。植物质体中包含两种ASPAT，即真核型ASPAT（AAT）和原核型ASPAT（PAT）（Robinson et al.，1994;Schultz and Coruzzi，1995）。与AAT相比，PAT不仅具有ASPAT活性，还具有预苯酸转氨酶活性（de la Torre et al.，2014）。拟南芥（Arabidopsis thaliana）作为模式植物，其ASPAT基因家族较小，仅含有5种AAT和1种PAT（de la Torre et al.，2006）。其中，ASPAT2和ASPAT4基因在细胞溶质中发挥功能;ASPAT3和ASPAT5基因在叶绿体中行使功能;ASPAT1则在线粒体行使功能（Schultz and Coruzzi，1995）;拟南芥PAT基因与上述5种AAT基因的序列相似度较低，但与蓝细菌PAT基因序列相似度较高（de la Torre et al.，2006）。有研究表明，PAT与发育中的叶绿体蛋白积累密切相关（Graindorge et al.，2014），已从高等植物如发豆、番茄和羽扇豆等中成功克隆并鉴定（Martins et al.，2002;Miesak and Coruzzi，2002;Silvente et al.，2003）。Sentoku等（2000）研究发现，转ASPAT基因烟草的线粒体或胞质中ASPAT基因过表达，其ASPAT活性比野生型烟草高3倍，且磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因（PEPC）转录水平明显上调。Miesak和Coruzzi（2002）研究发现，拟南芥胞质ASPAT2基因参与种子天冬氨酸和天冬酰胺的合成。Zhou等（2009）研究发现，水稻叶绿体或胞质过表达ASPAT基因时其种子中的总游离氨基酸含量明显增加。【本研究切入点】目前，在拟南芥、烟草和水稻等植物中ASPAT基因已被深入研究。与这些材料相比，杨树具有生长迅速、环境适应性强、易无性繁殖和多年生长等特点，可用于长期研究目的基因在不同生长周期或不同环境条件下的生物学功能，但至今鲜见有关杨树ASPAT基因家族鉴定及表达分析的研究报道。【拟解决的关键问题】根据拟南芥ASPAT蛋白氨基酸序列，在杨树基因组数据库（Phytozome 13.0）进行同源蛋白BLASTp比对分析，获得杨树ASPAT基因家族候选成员。利用生物信息学软件分析各成员序列和基因结构及编码蛋白的理化性质、亚细胞定位和保守基序等，并利用实时荧光定量PCR检测正常施氮处理下各基因的组织表达特异性，为深入研究ASPAT在杨树初级氮素同化中的生物学功能提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试材料为1年生小黑杨（P. simonii Carr.×P. nigra L.）茎段插穗，来源于东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室。主要试剂：植物总RNA提取试剂盒购自上海恪敏生物科技有限公司;反转录试剂盒（PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser）购自TaKaRa公司;实时荧光定量PCR试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。主要设备仪器：7500型荧光定量PCR仪（ABI，美国）。

1. 2 样品处理

将冷冻保存的1年生小黑杨茎段插穗（茎粗0.8～1.0 cm）进行扦插。1个月后对扦插苗进行截顶，长度为4～5个节间，约15 cm。每个幼苗保留2～3片嫩叶，清水培养至生根，移栽至蛭石中，以1 mmol/L硝酸铵（NH4NO3）作为唯一氮源，添加至不含氮素的LA营养液，每3 d浇200 mL LA营养液。处理至16 d，采集幼苗的根、茎和叶，每3株按组织混样，用锡纸进行包裹，液氮冷冻于-80 ℃保存。

1. 3 杨树ASPAT基因家族成员搜索及鉴定

从拟南芥全基因组数据库（TAIR）下载获得6个拟南芥ASPAT蛋白氨基酸序列，并在Phytozome 13.0数据库中进行BLASTp比对，获得杨树ASPAT基因家族候选成员。利用Pfam和SMART对候选基因进行进一步确认，以获得杨树ASPAT基因家族的染色体位置、编码区序列（CDS）及编码蛋白的氨基酸序列等信息。

1. 4 生物信息学分析

利用ExPASy ProtParam分析杨树ASPAT的分子量和等电点;运用Plant-mPloc对杨树ASPAT进行亚细胞定位预测;利用GSDS绘制杨树ASPAT基因结构图，分析其外显子和内含子结构;利用MEME对杨树ASPAT蛋白的保守基序进行预测，参数预测数目设为5，长度设为6～50，其他参数均为默认设置。利用ClustalX 1.83将6个拟南芥ASPAT蛋白与杨树ASPAT蛋白进行同源比对，并采用MEGA 5.0的相邻连接法（Neighbor-Joining，NJ）构建系统发育进化树，校验参数BootStrap重复为1000次，其他参数均为默認值。运用SOPMA预测杨树ASPAT蛋白质二级结构;对杨树AAT与拟南芥AAT进行氨基酸序列比对，并从NCBI上下载多个物种的PAT蛋白氨基酸序列进行比对分析。

1. 5 组织表达特异性检测

采用植物总RNA提取试剂盒提取杨树样品的总RNA，用反转录试剂盒反转录合成cDNA。采用Primer 5.0设计定量引物（表1），由哈尔滨市新海基因有限公司合成。实时荧光定量PCR试剂盒检测杨树ASPAT基因家族成员在杨树根、茎和叶的表达情况，以PtActin2为内参基因。反应体系20.0 µL：SYBR Mixture 10.0 µL，cDNA模板2.0 µL，上、下游游引物各0.8 µL，ddH2O补足至20.0 µL。扩增程序：95 ℃预变性10 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共进行40个循环;95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s;60 ℃ 15 s。每个样品设3次重复，重复数据采用2-ΔΔCt方法进行计算相对表达量。

1. 6 统计分析

试验数据采用Excel 2017进行整理及制图。

2 结果与分析

2. 1 杨树ASPAT基因家族鉴定及编码蛋白的氨基酸序列分析结果

由表2和表3可知，从杨树基因组中共鉴定到9个ASPAT基因家族成员，CDS序列长度为1215～1791 bp，编码的氨基酸数目304～480个，理论等电点5.66～8.99，相对分子质量33.11～53.31 kD，脂融指数76.36～93.54。除了PtASPAT6和PtASPAT7蛋白为不稳定蛋白，其他均为稳定蛋白。9个ASPAT基因家族成员分布于第5、6、7、14、16和18号染色体，其中，PtASPAT9位于第5号染色体，PtASPAT1、PtASPAT2和PtASPAT5位于第6号染色体，PtASPAT8位于第7号染色体，PtASPAT6位于第14号染色体，PtASPAT7位于第16号染色体，PtASPAT3和PtASPAT4位于第18号染色体。PtASPAT1和PtASPAT3定位于叶绿体和线粒体，PtASPAT4、PtASPAT5、PtASPAT8和PtASPAT9定位于叶绿体，PtASPAT2和PtASPAT6定位于线粒体，PtASPAT7定位于细胞质。跨膜结构域数目为1～13，其中，PtASPAT9只有1个跨膜结构域，PtASPAT3有13个跨膜结构域。PtASPAT3和PtASPAT7疏水性分值（GARVY）分别为0.050和0.053，推测为疏水性蛋白，其余蛋白为亲水性蛋白。

由表4可知，9个杨树ASPAT蛋白的二级结构主要以α-螺旋、无规则卷曲和延伸链结构为主，β-转角所占比例均较小。其中PtASPAT1、PtASPAT2、PtASPAT3、PtASPAT4、PtASPAT5、PtASPAT6和PtASPAT7均以α-螺旋结构所占比例最大，为37.59%～46.78%，其次为无规则卷曲结构，占30.26%～35.82%;PtASPAT8和PtASPAT9则以无规则卷曲所占比例最大，分别为37.80%和38.75%，其次为α-螺旋结构，分别为35.39%和38.12%。

2. 2 系统发育进化树构建结果

采用MEGA5.0的相邻连接法构建系统发育进化树。拟南芥和杨树的ASPAT蛋白可聚为两大类，Ⅰ类为AAT蛋白，包括PtASPAT1～PtASPAT7和AtASPAT1～AtASPAT5;Ⅱ类为PAT蛋白，包括PtASPAT8、PtASPAT9和拟南芥PAT（AtPAT），PtASPAT8与PtASPAT9氨基酸序列相似度高达90%。由此推测，PtASPAT8和PtASPAT9为PAT，其他7个PtASPAT为AAT。

2. 3 杨树ASPAT基因家族成员基因结构分析结果

PtASPAT1和PtASPAT3均含10个内含子和11个外显子，PtASPAT2、PtASPAT6和PtASPAT9均含9个内含子和10个外显子，PATSPAT5含13个内含子和14个外显子，PtASPAT4含11个内含子和12个外显子，PtASPAT7含8个内含子和9个外显子;PtASPAT8含7个内含子和7个外显子。

2. 4 杨树ASPAT蛋白的保守基序及序列比对分析结果

杨树ASPAT蛋白共有5个保守基序，其中PtASPAT1～PtASPAT6与AtASPAT1～AtASPAT5一致，均含有5个保守基序，PtASPAT7缺少2个保守基序。PtASPAT8和PtASPAT9与AtPAT一致，仅含有1个相同的保守基序，进一步证实PtASPAT8和PtASPAT9为PAT。

杨树AAT蛋白（PtASPAT1、PtASPAT2、PtASPAT3、PtASPAT4、PtASPAT5、PtASPAT6和PtASPAT7）含有磷酸吡哆醛结合位点（SGTHNYSSK）、同源二聚体多肽结合位点（GAVAER）及催化残留活性位点（K）。从NCBI下载多个物种的PAT蛋白氨基酸序列，并与杨树PAT蛋白（PtASPAT8和PtASPAT9）进行比对分析。PtASPAT8和PtASPAT9含有磷酸吡哆醛结合位点（SGTHNYSSK）、同源二聚体多肽结合位点（GAVAER）及催化残留活性位点（K），与植物乳酸杆菌（Lactobacillus plantarum）、大肠杆菌（Escherichia coli str. K-12 sub）、短药野生稻（Oryza brachyantha）和拟南芥（A. thaliana）的PAT蛋白氨基酸序列的相似度为36%～77%，其中与AtPAT相似度最高，为77%，与植物乳酸杆菌PAT蛋白相似度最低，为36%。

2. 5 杨树ASPAT基因家族的组织表达特异性检测结果

正常氮素处理下，PtASPAT1基因在杨树根、茎和叶中的相对表达量无明显差异;PtASPAT2～PtASPAT9在根部的相对表達量较在茎和叶中的高，其中PtASPAT4基因在根部的相对表达量最高，是其他基因的3～23倍，其次是PtASPAT8基因，推测在杨树根部主要由PtASPAT4和PtASPAT8催化合成天冬氨酸。

3 讨论

植物氮利用效率可从两方面得到提高：一是增加土壤的施氮肥量，精准施肥;二是提高植物本身吸收和利用氮的能力。近年来研究发现，不同物种或品种间总吸氮量及在不同发育时期对氮的吸收、转化和同化能力均存在明显差异，因此，提高氮利用效率关键在于提高植物本身吸收和利用氮的能力（Krouk et al.，2010;Teng et al.，2017）。Murooka等（2002）研究发现，拟南芥过表达天冬酰胺合成酶基因（AS2）可增强植株谷氨酰胺的积累量。Cai等（2009）研究发现，过表达谷氨酰胺合成酶基因（GS1.1）使水稻产量明显增加，过表达GS1.2基因使水稻的氮素利用效率明显提高，且蛋白含量也有所增加。Sentoku等（2000）、Igarashi等（2009）研究表明，拟南芥和烟草过表达ASPAT基因时植株中的天冬氨酸含量均有所增加。周莹（2009）研究发现，转ASPAT1、ASPAT2和PAT基因的水稻植株过表达这3个基因时均可提高种子的氨基酸和蛋白含量。

本研究从杨树基因组库中共鉴定出9个PtASPAT基因，其中7个编码AAT蛋白，2个编码PAT蛋白，分别定位于叶绿体、线粒体和胞质中。但Ireland和Joy（1983）研究发现，植物中仅存在一种PAT。本研究结果显示，杨树的7个AAT蛋白和2个PAT蛋白均含有磷酸吡哆醛结合位点（SGTHNYSSK）、同源二聚体多肽结合位点（GAVAER）及催化残留活性位点（K），但数量和位置存在明显差异，其原因可能是AAT和PAT单体均包含质体靶向的N-末端信号肽，但二者对磷酸酯底物的识别、结合底物的稳定性及最佳结合方向均不同（Morino et al.，2004）。目前，对所结合底物的研究还不是很全面（Wilkie et al.，1996;de la Torre et al.，2009）。本研究的组织特异性表达检测结果显示，除PtASPAT1基因在杨树根、茎和叶中的表达量无明显差异外，其他8个PtASPAT基因在根部的表达量均高于在叶和茎中的表达量，尤其是PtASPAT4和PtASPAT8基因，其原因是植物NH4+的同化过程主要发生在根部，谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶（GS/GOGAT）循环将NH4+同化成谷氨酰胺和谷氨酸，再经由ASPAT催化转氨基反应，最终合成天冬氨酸，推测PtASPAT4和PtASPAT8基因在该过程发挥重要作用。今后应深入研究PtASPAT4和PtASPAT8基因在氮素同化机制的调控机制，以提高杨树根部氮素利用效率。

4 结论

杨树ASPAT基因家族成员主要在根部表达，尤其是PtASPAT4和PtASPAT8基因在杨树根部的初级氮素同化中发挥重要作用。

参考文献：

杜亚琳，陈海燕，徐丽琳，王琛，范莲雪. 2018. 黄瓜氮素胁迫相关基因CsAHP1的克隆及功能分析[J]. 河南农业科学，47（6）：92-97. [Du Y L，Chen H Y，Xu L L，Wang C，Fan L X. 2018. Cloning and function analysis of cucumber CsAHP1 gene involved in nitrogen tolerance[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences，47（6）：92-97.]

李源，张炎，哈丽哈什·依巴提，李青军. 2019. 新型尿素对膜下滴灌棉花产量及氮肥利用率的影响[J]. 江苏农业学报，35（1）：85-90. [Li Y， Zhang Y，Halihashi·Yibat，Li Q J. 2019. Effects of new-type urea on yield and nitrogen use efficiency of drip irrigated cotton under plastic film mulching[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Scien-ces，35（1）：85-90.]

梁成刚，张青，李敬，熊丹，许光利，汪燕，刘泉，黄鹏，李天. 2013. 水稻灌浆期高温对天冬氨酸代谢酶活性及其家族氨基酸含量的影响[J]. 中国水稻科学，27（1）：71-76. [Liang C G，Zhang Q，Li J，Xiong D，Xu G L，Wang Y，Liu Q，Huang P，Li T. 2013. Effects of high temperature on aspartate metabolic enzyme activity and its family amino acid content during rice filling period[J]. Chinese Rice Science，27（1）：71-76.]

刘宝林，邹小云，宋来强，官春云. 2017. 氮肥追施时期对油菜产量、效益及氮素吸收利用的影响[J]. 江西农业学报，29（11）：29-32. [Liu B L，Zou X Yun，Song L Q，Guan C Y. 2017. Effects of nitrogen fertilizer topdressing period on yield，benefit and nitrogen absorption and utilization of rapeseed[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，29（11）：29-32.]

刘红江，肖敏，张丽萍，陈留根，张岳芳，郭智，郑建初. 2017. 前氮后移对水稻氮素吸收和利用效率的影响[J]. 江苏农业学报，33（3）：550-554. [Liu H J，Xiao M，Zhang L P，Chen L G，Zhang Y F，Guo Z，Zheng J C. 2017. Nitrogen uptake and use efficiency of rice in response to postponed nitrogen application[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，33（3）：550-554.]

刘瑞响，曹晓良，陶勇生，张祖新. 2012. 不同氮素水平下玉米产量与zmAspAT基因表达分析[J]. 中国农学通报，28（24）：22-26. [Liu R X，Cao X L，Tao Y S，Zhang Z X. 2012. Analysis of maize yield and zmAspAT gene expre-ssion under different nitrogen levels[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin，28（24）： 22-26.]

馬文奇，张福锁，陈新平. 2006. 中国养分资源综合管理研究的意义与重点[J]. 科技导报，24（10）：64-67. [Ma W Q，Zhang F S，Chen X P. 2006. Significance and focus of research on integrated management of nutrient resources in China[J]. Science and Technology Review，24（10）：64-67.]

于妍，宋万坤，刘春燕，高运来，李文福，孙殿君，陈庆山，胡国华. 2008. 植物天冬氨酸代谢途径关键酶基因研究进展[J]. 生物技术通报，（S1）：7-11. [Yu Y，Song W K，Liu C Y，Gao Y L，Li W F，Sun D J，Chen Q S，Hu G H. 2008. Research progress on key enzyme genes in plant aspartate metabolic pathways[J]. Biotechnology Bulletin，（S1）：7-11.]

赵会杰，周颖，李华，王斯琪，许海良，蒲文宣，张锦韬，易克，汪耀富. 2017. 施氮量对烤烟叶片碳同化能力及同化产物分配的影响[J]. 河南农业大学学报，51（5）：603-608. [Zhao H J，Zhou Y，Li H，Wang S Q，Xu H L，Pu W X，Zhang J T，Yi K，Wang Y F. 2017. Effect of nitrogen app-lication rate on carbon assimilation capability and assimilation product distribution of flue-cured tobacco leaves[J]. Journal of Henan Agricultural University，51（5）：603-608.]

周莹. 2009. 水稻中天冬氨酸转氨酶的分子生物学研究和转基因应用[D]. 武汉：华中农业大学. [Zhou Y. 2009. The reseach of molecular biology and application of aspartate aminotransferase in rice[D]. Wuhan：Huazhong Agricultural University.]

Cai H，Zhou Y，Xiao J，Li X，Zhang Q，Lian X. 2009. Overexpressed glutamine synthetase gene modifies nitrogen metabolism and abiotic stress responses in rice[J]. Plant Cell Reports，28（3）：527-537.

de la Torre F，Cañas R A，Pascual M B，Avila C F，Cánovas M. 2014. Plastidic aspartate aminotransferases and the biosynthesis of essential amino acids in plants[J]. Journal of Experimental Botany，65（19）：5527-5534.

de la Torre F，Moya-García A，Suárez M F，Rodríguez-Caso C，Cañas R A，Sánchez-Jiménez F，Cánovas F M. 2009. Molecular modelling and site-directed mutagenesis reveal essential residues for catalysis in a prokaryote-type aspartate aminotransferase[J]. Plant Physiology，149（4）：1648-1660.

de la Torre F，Santis L D，Crespillo R，Francisco M C. 2006. Identification and functional analysis of a prokaryotic-type aspartate aminotransferase：Implications for plant amino acid metabolism[J]. Plant Journal for Cell & Molecular Biology，46（3）：414-431.

Graindorge M，Giustini C，Kraut A，Moyet L，Curien G，Matringe M. 2014. Three different classes of aminotransfera-ses evolved prephenate aminotransferase functionality in arogenate-competent microorganisms[J]. Journal of Biological Chemistry，289（6）：3198-3208.

Igarashi D，Ishizaki T，Totsuka K，Ohsumi C. 2009. ASN2 is a key enzyme in asparagine biosynthesis under ammo-nium sufficient conditions[J]. Plant Tissue Culture Letters，26（1）：153-159.

Ireland R J，Joy K W. 1983. Subcellular localisation of asparaginase and asparagine aminotransferase in Pisum sativum leaves[J]. Plant Physiology，72（4）：1127-1129.

Krouk G，Crawford N M，Coruzzi G M，Yifang T，Sonnewald U，Frommer W B. 2010. Nitrate signaling：Adaptation to fluctuating environments[J]. Current Opinion in Plant Bio-logy，13（3）：265-272.

Martins M L L，Mourato M P de F B，Mendonça A P A de V e. 2002. Characterization of aspartate aminotransferase isoenzymes from leaves of Lupinus albus L. cv Estoril[J]. Journal of Biochemistry and Molecular Biology，35（2）：220-227.

Miesak B H，Coruzzi G M. 2002. Molecular and physiological analysis of arabidopsis mutants defective in cytosolic or chloroplastic aspartate aminotransferase[J]. Plant Physio-logy，129（2）：650-660.

Morino K，Olsen O A，Shimamoto K. 2004. Silencing of the aleurone-specific Ltp2-gus gene in transgenic rice is reversed by transgene rearrangements and loss of aberrant transcripts[J]. Plant & Cell Physiology，45（10）：1500.

Murooka Y，Mori Y，Hayashi M. 2002. Variation of the amino acid content of Arabidopsis seeds by expressing soybean aspartate aminotransferase gene[J]. Journal of Bioscience & Bioengineering，94（3）：225-230.

Robinson D L，Kahn M L，Vance C P. 1994. Cellular localisation of nodule-enhanced aspartate aminotransferase in Medicago sativa L.[J]. Planta，192（2）：202-210.

Schultz C J ，Coruzzi G M. 1995. The aspartate aminotransferase gene family of Arabidopsis encodes isoenzymes loca-lized to three distinct subcellular compartments[J]. The Plant Journal，7（1）：61-75.

Sentoku N，Taniguchi M，Sugiyama T，Ishimaru K，Ohsugi R，Takaiwa F，Toki S. 2000. Analysis of the transgenic tobacco plants expressing Panicum miliaceum aspartate aminotransferase genes[J]. Plant Cell Reports，19（6）：598-603.

Silvente S，Camas A，Lara M. 2003. Molecular cloning of the cDNA encoding aspartate aminotransferase from bean root nodules and determination of its role in nodule nitrogen metabolism[J]. Journal of Experimental Botany，54（387）：1545-1551.

Teng W，He X，Tong Y P. 2017. Transgenic approaches for improving use efficiency of nitrogen，phosphorus and potassium in crops[J]. Journal of Integrative Agriculture，16（12）：2657-2673.

Wilkie S E，Lambert R，Warren M J. 1996. Chloroplastic aspartate aminotransferase from Arabidopsis thaliana：An examination of the relationship between the structure of the gene and the spatial structure of the protein[J]. The Biochemical Journal，319（3），969-976.

Zhou Y，Cai H，Xiao J，Li X，Lian X. 2009. Overexpression of aspartate aminotransfer ase genes in rice resulted in altered nitrogen metabolism and increased amino acid content in seeds[J]. Theoretical and Applied Genetics，118（7）：1381-1390.

（責任编辑 陈 燕）