微小RNA-218对耐顺铂宫颈癌细胞生物学特性影响的研究*

邵 琼,苏瑞芬,许 海

(1.湖北省来凤县人民医院妇产科,湖北恩施 445700;2.湖北省恩施土家族苗族自治州中心医院妇产科，湖北恩施 445000;3.湖北中医药大学黄家湖医院妇科，湖北武汉 430070)

宫颈癌的发病率在女性恶性肿瘤中高居第二，除手术治疗外，化疗也是重要的治疗手段之一[1]，顺铂是临床上治疗宫颈癌的一线化疗药物，但由于各种复杂的机制，相当一部分患者会因为对顺铂产生耐药性而导致化疗失败[2-3]。增加耐药细胞对顺铂的敏感性是挽救耐药病例的一个重要研究思路。研究发现微小RNA(miRNA)在宫颈癌中表达异常[4]。microRNA 是一类非编码单链小RNA，核苷酸长度为18～25个，可以通过调控活性靶点而参与肿瘤的发生[5]。其中miRNA-218(miR-218)在宫颈癌中的表达显著降低，可能是潜在的肿瘤抑制因子[6]。目前，有关miR-218对于耐药宫颈癌细胞作用的研究较少。本研究建立了耐顺铂的宫颈癌细胞株，并使其过表达miR-218，观察了耐药细胞生物学特性的改变，取得了一定的研究成果，现报道如下。

1 材料与方法

1.1实验材料 人宫颈癌细胞SiHa细胞系购于北京中原公司；顺铂购于齐鲁制药公司；DMEM培养基、10%胎牛血清、青霉素、链霉素、0.25%胰蛋白酶购于Gibco公司；慢病毒载体质粒、miRNA-218基因片段购于上海吉玛公司；miRNA快速提取试剂盒、逆转录试剂盒、荧光定量PCR检测试剂盒购于北京天根公司。流式细胞仪为美国BD公司生产。Transwell小室由美国Corning公司生产。

1.2细胞培养 在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中加入双抗(100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素)，将SiHa细胞置于培养基中，当细胞融合率达到80%时，用0.25%胰蛋白酶消化、传代，于5%CO2培养箱中进行培养，保持恒温37 ℃。

1.3耐顺铂宫颈癌细胞株培养 通过持续缓慢增加顺铂浓度的方法建立耐药细胞株[7]，在SiHa细胞培养液中加入0.1 μg/mL低浓度的顺铂，持续作用2周后，待细胞可在此浓度中稳定生长，再将顺铂浓度增加至0.5 μg/mL，6周后增加至1.0 μg/mL，12周后加至1.5 μg/mL，8周后加至2.0 μg/mL，11周后观察在培养液中仍稳定增殖的细胞株即为耐顺铂SiHa细胞株(耐顺铂SiHa)。

1.4miR-218过表达耐顺铂SiHa细胞株建立及表达检测 将miR-218 序列和阴性对照序列扩增并克隆到慢病毒质粒LV3上，miR-218 基因片段为5′-TTG TGC TTT TGT GCT TGA TCT AAC CAT GT-3′，阴性对照为5′-TTC TCC GAA CGT GTC ACG TTT C-3′，严格按照产品操作手册进行转染耐顺铂SiHa细胞，在96孔板中每孔加入100 μL完全培养基，接种耐顺铂SiHa细胞3.5×103，感染细胞病毒滴度为1×107TU/mL，并加入0.5 g/L的聚凝胺，72 h后用荧光显微镜下观察细胞发光情况，加入1.2 mg/L嘌呤霉素杀死未转染细胞，筛选出的细胞即为过表达miR-218的耐顺铂SiHa细胞株(miR-218/耐顺铂SiHa)，期间根据细胞的生长状况进行传代培养。获得稳定生长表达的细胞株后，按照miRNA快速提取试剂盒说明严格操作，提取SiHa、耐顺铂SiHa、miR-218/耐顺铂SiHa 3组细胞的RNA，逆转录合成cDNA，按照逆转录试剂盒进行扩增，采用荧光定量PCR试剂盒检测各组细胞miRNA-218的表达量。

1.5MTT法检测细胞在顺铂中的增殖情况 采用0.25%胰蛋白酶消化SiHa、耐顺铂SiHa、miR-218/耐顺铂SiHa 3组细胞，调整细胞数量，离心后接种于96孔板，同时采用0.4 μg/mL的顺铂处理，采用MTT法测定吸光度(A)值 ，连续测量7 d，根据A值绘制生长曲线反映细胞增殖活力。

1.6顺铂药物敏感性测定 采用0.25%胰蛋白酶消化3组细胞，调整细胞数量，离心后接种于96孔板，并分别用0、0.000 4、0.004、0.04、0.4、4、40 μg/mL浓度顺铂处理，72 h后采用MTT法测定吸光度，计算IC50。

1.7划痕试验 将细胞接种于96孔板中，采用3%胎牛血清培养，待细胞汇合达85%时，用移液枪枪头沿孔底做一直径的笔直划痕，并吹走划落细胞，分别在0、24 h时在200倍显微镜下观察和测量划痕闭合宽度。

1.8Transwell法测定细胞侵袭能力 0.25%胰蛋白酶消化3组细胞，调整细胞数量，使用无血清培养基重悬，在小室下室加入10%血清培养基600 μL，小室上室加入150 μL细胞悬液，放入5%CO2的培养箱中，恒温37 ℃培养10 h后甲醛固定小室，结晶紫染色，底膜切片移至载玻片中性树胶封片，200倍光镜下随机取5个视野计数细胞数取平均值，即为穿膜细胞数。

1.9统计学处理 应用SPSS19.0分析软件，组间比较用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组细胞miR-218的表达量 以SiHa组细胞为对照组,其miR-218的相对表达量为1.00±0.00。miR-218/耐顺铂SiHa组细胞的miR-218相对表达量为5.26±0.34，显著高于SiHa组(t=20.65,P<0.05)。耐顺铂SiHa组细胞的相对表达量为1.43±0.21，与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，低于miR-218/耐顺铂SiHa组(t=18.76,P<0.05)。耐药株细胞的miR-218表达量与亲本株差异无统计学意义，SiHa细胞发生耐药的过程可能无miR-218参与，转染miR-218后表达量显著增加，证实转染成功。

2.2各组细胞在顺铂中的增殖克隆及IC50在含0.4 μg/mL的顺铂培养液中，采用MTT法检测细胞增殖情况，连续5 d，根据所测得的A值绘制生长曲线，见图1。在1～2 d，3组细胞增殖差异无统计学意义(P>0.05)；3～5 d时，耐顺铂SiHa组的增殖显著高于miR-218/耐顺铂SiHa组，差异有统计学意义(P<0.05)，miR-218/耐顺铂SiHa组与SiHa组之间增殖水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。耐顺铂SiHa 组的IC50显著高于SiHa组[(0.15±0.03)μg/mL]与miR-218/耐顺铂SiHa组[(0.23±0.06)μg/mL]。

注：从上到下的三条生长曲线依次为耐顺铂SiHa组、SiHa组、miR-218/耐顺铂SiHa组图1 各组细胞生长曲线

2.3划痕试验 分别在0、24 h时在200倍显微镜下观察和测量划痕闭合宽度，SiHa、耐顺铂SiHa、miR-218/耐顺铂SiHa组的划痕愈合率分别为(28.16±2.14)%、(29.35±1.86)%、(13.45±1.02)%，miR-218/耐顺铂SiHa组划痕愈合率显著低于SiHa与耐顺铂SiHa组,差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

图2 划痕试验检测各组细胞迁移能力(200×)

2.4细胞侵袭能力 200倍光镜下观察小室底膜细胞数，SiHa、耐顺铂SiHa、miR-218/耐顺铂SiHa组细胞穿膜数分别为123.40±21.65、132.50±22.32、78.90±12.54，miR-218/耐顺铂SiHa组细胞穿膜数显著低于SiHa与耐顺铂SiHa组,差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

图3 Transwell法测定细胞侵袭能力(200×)

3 讨 论

从组织学分类，宫颈癌属于鳞癌，人宫颈鳞癌SiHa细胞是最常用于肿瘤研究的细胞系之一。顺铂作为宫颈癌化疗的一线药物效果显著，但临床一旦发生耐药，治疗效果将会受到巨大影响。宫颈癌耐药的发生可能与化疗药物进入肿瘤细胞减少或溢出增多，药物在肿瘤细胞内活性减弱，化疗药物作用的靶分子改变，肿瘤DNA损伤修复能力增强，肿瘤细胞凋亡抑制相关[8]。宫颈癌细胞耐药的机制尚不明确，目前认为这些机制或多或少参与了宫颈癌耐顺铂的过程中。有学者发现耐药株细胞学形态发生了改变，可能通过这种改变增加代谢，增强自身修复能力[9]。建立耐药株模型，研究增加耐药株对药物敏感性的方法具有重大科研和临床价值。耐药株的建立目前有两种方法，一是低浓度持续加量诱导法，优点是细胞耐药性较稳定成功率高；另一种方法是大剂量冲击间断给药法，优点是更接近于临床耐药发生过程。在研究了诸多文献后，本研究采取了前者的造模方式，经过40周的培养，成功获得了耐顺铂SiHa细胞株。

miRNA在癌症发生发展中发挥了重要作用，miRNA是一类高度保守的非编码单链小分子RNA,可通过与多个靶基因的mRNA的3′端的非翻译区发生不完全的互补配对,并在转录后抑制基因的表达。OLIVETO等[10]报道，miRNA可通过扩增表达或减少表达来实现对癌症的抑制，几乎参与了肿瘤发生发展的每一个步骤,在肿瘤发病机制中发挥了重要作用。50%以上的miRNAs定位于肿瘤的相关基因组区域内,并可由染色体异常而导致miRNAs基因拷贝数的改变,进而出现miRNAs的表达失调。几乎所有的肿瘤组织内均可检测出miRNAs的异常表达。miR-218在乳腺癌、肝细胞癌、神经胶质瘤等诸多恶性肿瘤中表达下降[11-13]，JIANG 等[14]研究报道宫颈癌患者血清中miR-218表达量显著低于正常妇女，崔英等[15]发现宫颈癌组织中miR-218的表达量显著高于正常宫颈组织，石玉荣等[16]发现miR-218可以预测宫颈癌的侵袭性，其高表达可能抑制宫颈癌细胞的迁移。在本研究中，将miR-218基因通过慢病毒感染的方式转染入耐药SiHa细胞株，通过PCR荧光定量检测，发现miR-218/耐顺铂SiHa细胞株中miR-218的表达量显著增加，同时发现亲本株细胞与耐药株细胞的miR-218表达量差异无统计学意义(P>0.05)，说明耐药的发生可能与miR-218表达量无关。在含有一定量顺铂的培养基中miR-218/耐顺铂SiHa的增殖速度和IC50显著低于耐药株，但与亲本株无差异，说明虽然耐药的发生过程与miR-218无关，但过量表达miR-218后可以增加耐药株细胞对顺铂的敏感性。之后的划痕试验和Transwell试验均证实了miR-218对耐药株细胞迁移和侵袭能力的抑制，这与目前大多研究结果相一致。

本研究通过持续缓慢增加顺铂浓度的方法成功构建了SiHa耐药株，慢病毒转染法建立了过表达miR-218的SiHa细胞株及耐药株。与SiHa及耐顺铂SiHa相比，miR-218/耐顺铂SiHa细胞株的miR-218表达量显著升高；在含有顺铂培养液中，耐顺铂SiHa的克隆增殖与IC50显著高于SiHa与miR-218/耐顺铂SiHa，miR-218/耐顺铂SiHa的划痕愈合率与细胞穿膜次数显著低于SiHa及耐顺铂SiHa。

4 结 论

miR-218基因可能不参与宫颈癌细胞的耐药发生，但对于已经发生耐药的宫颈癌细胞，转染miR-218基因后使基因过表达miR，则可以增加对顺铂的敏感性，同时迁移和侵袭能力下降，对于临床耐药而导致化疗失败的患者而言，提供了一条新的科研和治疗思路。