蛇床子素壳寡糖纳米胶束中蛇床子素的含量测定*

孙冰冰，李莹莹，常金花，李松涛，赵红玲，王汝兴

（承德医学院中药研究所/河北省中药研究与开发重点实验室，河北承德 067000）

蛇床子为伞形科植物蛇床(Cnidium monnieri(L.) Cuss.)的干燥成熟果实，为我国传统中药材，含有香豆素类和挥发油等成分，其中蛇床子素是其最主要的香豆素类成分，具有多种药理学活性。现代药理学研究表明，蛇床子素具有抗炎、抗肿瘤、抗骨质疏松、抗真菌及肝脏保护等多种药理学作用，具有良好的研究和开发前景[1-2]。

聚合物胶束是近年来快速发展的一种新型载药系统，它具有内核疏水、外壳亲水的核-壳结构，属于热力学稳定体系[3-4]。聚合物胶束的疏水性内核可包载疏水性药物，增加难溶性药物的溶解度和稳定性，从而提高难溶性药物的生物利用度[5]。聚合物胶束的粒径一般在1～1000nm之间，因而能避免机体对纳米药物的快速清除及免疫系统的吞噬，有利于药物在肿瘤组织中的积累。此外，聚合物胶束还具有肿瘤细胞靶向，改变抗肿瘤药物的细胞摄取途径、亚细胞定位及克服肿瘤多药耐药等诸多优点[6-7]，使得其成为难溶性药物理想的输送系统。

由于蛇床子素难溶于水，口服后肠道吸收差，故生物利用度较低，影响了蛇床子素的药理作用。为此，本课题组将蛇床子素制成新型靶向制剂—蛇床子素壳寡糖纳米胶束，利用靶向载体技术，以达到提高蛇床子素生物利用度的目的。本研究采用高效液相色谱法测定了该制剂中蛇床子素的含量，以期更好地控制蛇床子素壳寡糖纳米胶束的质量。

1 仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），IKA漩涡混匀仪（上海莱贝科学仪器有限公司）；85-1型集热式恒温加热磁力搅拌器（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；pHS-3C型精密pH计（上海雷磁仪器厂）；超滤离心管（上海驷芮科技有限公司）；透析袋（截留分子量3500，上海源叶生物科技有限公司）。

蛇床子素原料药（西安天本生物工程有限公司，批号：TBSC20180504-5）；蛇床子素对照品（成都普菲德生物技术有限公司，批号：18032005）；蛇床子素壳寡糖纳米胶束（自制，批号：20190316，20190412，20190419）；壳寡糖（济南海得贝海洋生物工程有限公司）；硬脂酸（天津市东丽区天大化学试剂厂）；端醛基聚乙二醇（mPEG，上海子起生物科技有限公司）；叶酸（FA，美国Sigma公司）；甲酸（天津市科密欧化学试剂有限公司）。甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent C18色谱柱(4.6mm×200mm，5μm)，流动相甲醇-0.5%甲酸(75：25，v/v)，进样量10μl，流速1.0ml/min，λ=322nm，柱温为25℃。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取3.0mg蛇床子素，置于10ml容量瓶中，加入流动相溶解并定容，制成300.0μg/ml的蛇床子素对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 精密称取2.0mg蛇床子素壳寡糖纳米胶束，置于10ml容量瓶中，以适量甲醇超声溶解，再加入流动相定容，制成200.0μg/ml的蛇床子素壳寡糖纳米胶束溶液。精密称取2.0mg空白壳寡糖纳米胶束，置于10ml容量瓶中，以适量甲醇超声溶解，再加入流动相定容，制成200μg/ml的空白壳寡糖纳米胶束溶液。

2.4 专属性考察 分别精密吸取蛇床子素对照品溶液、空白壳寡糖纳米胶束溶液和蛇床子素壳寡糖纳米胶束溶液，按照“2.1”的色谱条件进样分析，记录色谱图（附图）。蛇床子素的色谱峰与基线完全分离，空白壳寡糖纳米胶束对蛇床子素的检测无干扰，表明该分析方法专属性良好。

附图 三种溶液的色谱图

2.5 标准曲线的绘制 将300.0μg/ml的蛇床子素对照品溶液，置于10ml量瓶中，以流动相分别将其稀释成浓度为0.78μg/ml、1.56μg/ml、3.13μg/ml、6.25μg/ml、12.50μg/ml、25.00μg/ml和50.00μg/ml的蛇床子素对照品溶液。按照“2.1”的色谱条件进样分析，以蛇床子素的峰面积(A)为纵坐标、浓度(C)为横坐标绘制标准曲线，得标准曲线方程：A=25.03×C-1.513(R=1.000)。结果显示在0.78～0.00μg/ml的范围内，蛇床子素的浓度与其峰面积线性关系良好。

2.6 精密度试验 精密吸取浓度为12.50μg/ml的蛇床子素对照品溶液，连续进样6次，连续测定3d并记录峰面积，分别计算日内精密度和日间精密度。结果显示蛇床子素的日内精密度RSD为0.05%，日间精密度RSD为1.62%，表明精密度良好。

2.7 重复性试验 精密吸取同一批蛇床子素壳寡糖纳米胶束供试品溶液6份过0.45μm微孔滤膜，按照“2.1”的色谱条件进样测定，记录峰面积，RSD为0.38%，表明该方法重复性较好。

2.8 稳定性试验 精密吸取同一蛇床子素壳寡糖纳米胶束溶液，分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h按照“2.1”的色谱条件进样分析，记录峰面积。结果峰面积的RSD为1.05%，表明供试品溶液在室温条件下24h内稳定性良好。

2.9 回收率试验 分别精密量取1.4ml、1.7ml和2.0ml浓度为100.00μg/ml的蛇床子素对照品溶液各3份，置于10ml容量瓶中，分别加空白壳寡糖纳米胶束溶液1.0ml，以流动相定容至刻度，得到浓度分别为14.0μg/ml、17.0μg/ml和20.0μg/ml的供试溶液共9份。按照“2.1”的色谱条件进样测定并记录峰面积，计算回收率。结果见表1：

表1 回收率试验结果

2.10 蛇床子素壳寡糖纳米胶束中蛇床子素的含量测定 分别取3批蛇床子素壳寡糖纳米胶束，按照“2.3”的方法配制供试品溶液，按照“2.1”的色谱条件进样测定。蛇床子素壳寡糖纳米胶束中蛇床子素的含量测定结果见表2：

表2 蛇床子素壳寡糖纳米胶束中蛇床子素的含量测定结果

3 讨论

本研究在紫外200～400nm的范围内对蛇床子素的吸收及分离效果进行了考察，结果表明在波长为322nm处蛇床子素有最大吸收，故确定322nm为蛇床子素的检测波长。

蛇床子素属香豆素类化学成分，又称为甲氧基欧芹酚，为强脂溶性香豆素类化合物，难溶于水，易溶于碱性溶液及甲醇、乙醇、氯仿等有机溶剂。鉴于此，本研究在流动相的选择上根据文献[8-9]分别以甲醇-甲酸、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%冰醋酸等不同的流动相系统对蛇床子素进行测定。结果显示以甲醇-0.5%甲酸(75：25，v/v)为流动相时，蛇床子素与构成胶束辅料的分离效果最好，峰形较好，且基线平稳、保留时间适中，故选择甲醇-0.5%甲酸(75：25，v/v)为本研究中使用的流动相。以甲醇-0.5%甲酸(75：25，v/v)为流动相，采用高效液相色谱法测量了3批蛇床子素壳寡糖纳米胶束中蛇床子素的含量，分别为154.0μg/ml、167.2μg/ml和175.1μg/ml。

本研究建立了高效液相色谱法测定蛇床子素壳寡糖纳米胶束中蛇床子素含量的方法，结果表明该方法准确、简单、可靠，且专属性强，可用于蛇床子素壳寡糖纳米胶束中蛇床子素的含量测定，为今后蛇床子素新型靶向制剂的深入研究提供了基础。