细胞外囊泡对肿瘤生物学特性的影响研究进展

贺玲 张小燕 杨雅芝 李剑

[摘要] 肿瘤的生长、侵袭和转移依赖于肿瘤细胞与其所处微环境中基质细胞的“交叉对话”，这种“交叉对话”主要涉及这两种细胞的可溶因子的分泌、膜包囊颗粒的释放以及细胞与细胞间的直接接触。这些膜包囊颗粒被称为细胞外囊泡（EVSs），肿瘤细胞比正常细胞可分泌更多的EVSs，这些EVSs通过依赖于内体分选复合物蛋白（ESCRT）和不依赖于ESCRT的途径将蛋白质、DNA、RNA等“内容物”分选入体内。这些“内容物”促进肿瘤细胞与基质细胞之间的信息的转递，从而支持肿瘤血管生成，侵袭转移、耐药及使得肿瘤细胞获得恶性表征。

[关键词] 细胞外囊泡;信号分选;肿瘤微环境;肿瘤-基质细胞

[中图分类号] R730.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）07（a）-0062-04

Advance in research on the effects of extracellular vesicles on the biological characteristics of tumor

HE Ling1   ZHANG Xiaoyan2   YANG Yazhi3   LI Jian3

1.Clinical Department， Jiangxi Health Vocational College， Jiangxi Province， Nanchang   330052， China; 2.Medical College of Nanchang University， Jiangxi Province， Nanchang   330006， China; 3.Key Blood Laboratory， the Second Affiliated Hospital of Nanchang University， Jiangxi Province， Nanchang   330052， China

[Abstract] Tumor growth， invasion and metastasis depend on the "cross-talk" between tumor cells and stromal cells in their microenvironment， which mainly involves the secretion of soluble factors of these two kinds of cells， the release of membrane-tomont particles and the direct contact between cells. These vesicles are known as extracellular vesicles （EVSs）， and tumor cells secrete more EVSs than normal cells， which separate proteins， DNA， RNA， and other "contents" into the body through both escrt-dependent and escrt-independent pathways. These "contents" facilitate the transmission of information between tumor cells and stromal cells， thus supporting tumor angiogenesis， invasion and metastasis， drug resistance， and malignant characterization of tumor cells.

[Key words] Extracellular vesicles; Signal sorting; Tumor microenvironment; Tumor-stroma cell

細胞外囊泡（EVSs）是由脂质双分子层包绕形成的球状膜性囊泡，通过细胞分泌产生，包括外泌体、膜微粒、微囊泡及凋亡小体等。细胞间可以通过释放EVSs进行“交叉对话”，这些EVSs可以联系并改变相邻或远处靶细胞的行为。EVSs通过介导微环境中肿瘤和基质细胞之间的相互作用促进肿瘤的进展。本文将探讨EVSs的产生及体内携带物的分选机制，以及这些过程如何在肿瘤中失去“调控”，并因此改变了EVSs的生物学特性，及如何影响肿瘤的生物学特性。

1 EVSs的产生

EVSs能选择性地将母细胞来源的多种生物活性物质包装进其双分子层膜结构中或携带于膜表面或包裹入其囊泡，如脂质、细胞因子、特异性及非特异性蛋白、DNA、RNA等。目前关于EVSs形成、释放及EVSs内成分被分选进入腔内囊泡的具体机制仍不清楚。在对外泌体的研究中发现，其生成有依赖于转运必需内体分选复合物蛋白（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）和不依赖于ESCRT的途径。ESCRT包括ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ和ESCRT-Ⅲ等4个可溶性多蛋白复合体以及Vps4-Vta1复合物[1]。在依赖于ESCRT的外泌体生成途径中，由泛素标记的蛋白质被转运到内体膜上，其通过ESCRT系统导致内体膜的内陷，从而将蛋白质组分释放到内体腔内形成内腔囊泡。ESCRT-0的功能是识别和富集底物，同时识别被泛素修饰的靶蛋白。当靶蛋白定位富集后，ESCRT-Ⅰ中的TSG101蛋白被招募至泛素化的蛋白质上形成复合体，并激活ESCRT-Ⅱ。激活的ESCRT-Ⅱ能导致ESCRT-Ⅲ复合体在出芽体颈部的寡聚，并且剪切芽体使得小泡释放至内体腔中，形成多囊泡体。最后，在Vps4的协助下，ESCRT-Ⅲ复合体从内体膜上解聚释出[2]。某些外泌体中的蛋白质释放并不依赖于ESCRT复合体，Trajkovic等[3]研究发现，在少突神经细胞中，载脂蛋白PLP分选进入外泌体和释放，并不依赖于TSG101蛋白和ALIX蛋白，而是与神经酰胺有关。含有特定含量神经酰胺的脂筏结构决定外泌体的生成水平。同时，另外一些特定的脂筏结构和高度有序的低聚反应，会决定外泌体中的蛋白质成分。在树突状细胞中，MHC-Ⅱ被分选至外泌体中，需要含有CD9脂筏结构的协助[4]。由抗体交叉反应引起的低聚反应会增强免疫蛋白进入外泌体。总之，这些研究结果提出了一个主要问题，即不同的分选机制是否能将特定分子并入EVSs或是否存在携带不同“货物”的不同囊泡亚群。因此，干扰特定的分选机制可能影响肿瘤细胞释放的EVSs或EVSs亚型，并影响肿瘤微环境中的肿瘤-基质细胞交流。

2 胞外囊泡“货物”

EVSs在肿瘤微环境中的功能特性取决于它们装载“货物”以及它们的释放和摄取的动力学。鉴定肿瘤EVSs的促肿瘤“成分”以及导致它们并入囊泡的途径是当前该领域中的研究热点之一。

2.1 蛋白质

在EVSs产生过程中，蛋白质通过直接与四跨膜蛋白的结合或通过包埋在富含四跨膜蛋白的微域中的方式，促进它们分选到EVSs中。由于肿瘤外泌体携带促肿瘤发生发展的重要蛋白，如癌蛋白、生长因子和免疫调节分子等。因此，通过干扰特定蛋白质加载到囊泡的蛋白-蛋白相互作用网络中，可提供一种靶向干扰的方式来削弱EVSs的致癌能力。

2.2 RNA

2006年，Ratajczak[5]等首先提出了供体和受体细胞之间的RNA水平转移。随后，Valadi等[6]证明了由EVSs运输的mRNA分子实际上可以翻译成蛋白质，从而为细胞之间遗传物质水平转移提供了证据。除mRNA外，外泌体内的小非编码RNA通过基因调节也可发挥功能。第一个提供通过外泌体功能性转移小RNA的证据是，2010年，Pegtel等[7]使用EB病毒感染B细胞时发现小RNA（miRNA）通过外泌体分泌并可调节受体树突细胞中的基因表达。尽管某些EVSs相关miRNA在肿瘤中具有明显的作用，但它们通过EVSs转移负责促进体内肿瘤进展的确切证据仍然缺乏。事实上，很难区分到底是由EVSs-介导转移的miRNA还是受体细胞中的内源性miRNA表达所起的作用。Thomou等[8]最近提供了一个引人注目的体内EVSs介导的miRNA转移实验。作者使用特异性切酶敲除的小鼠模型证实，棕色脂肪是EVSs相关循环miRNA的主要来源。将正常脂肪组织移植到该小鼠中不仅可以恢复EVSs miRNA的循环水平，而且可以调节其在远端器官中的基因表达。目前已经发现许多已知的RNA结合蛋白（RBP）可介导RNA分选进入外泌体内，但这些蛋白如何连接到内体系统仍是未知数。

2.3 DNA

研究[9]报道，EVSs中存在片段化基因组DNA（gDNA）、线粒体DNA（mtDNA）、寄生DNA等。尽管这些DNA并入EVSs中的机制仍有待阐明，但EVSs中gDNA片段均匀分布于整个基因组的事实表明分选存在随机性。然而，由于所有研究均依赖超速离心法作为外泌体纯化方法，因此难以完全排除DNA被主动分选到外泌体中的证据，因为使用这种分离方法很难区分囊泡、蛋白质复合物和凋亡小体。EVSs相关DNA可存在于EVSs表面上。

目前，关于EVSs进行DNA转移的生理意义还不清楚。研究[10]表明，DNA损伤后，基因组DNA片段可以输出到细胞质，在那里它们可以触发细胞质DNA传感器，导致细胞衰老或凋亡。EVSs分泌的DNA片段可阻止细胞质DNA传感器的激活，从而有助于细胞稳态[11]。

3 肿瘤EVS释放机制失调

大量证据[12-13]表明，与正常细胞比较，肿瘤细胞释放更多量的EVSs，无论细胞内在信号还是外在环境信号都可以增强肿瘤细胞释放EVSs。如：肿瘤细胞内在信号RalB的超活化、YKT6的过度表达和Rho-ROCK信号的升高都可增强肿瘤细胞EVSs产生。活化EGFRvⅢ和H-RASV12信号传导途径也可以增加肿瘤细胞的EVSs产生。此外，研究[14]表明，原癌基因SRC通过磷酸化多配体蛋白聚糖和syntenin的胞质结构域特异性刺激外泌体生物合成途径。肿瘤细胞除了比正常细胞可释放更多的EVSs之外，其所“装载”的蛋白质和RNA也是不同的，这种结果的产生可能是由于致癌信号的活化或是微环境条件的改变所致。肿瘤细胞EVSs释放和装载的“货物”影响了肿瘤微环境中乃至远处转移部位的肿瘤和基质之间的“交叉对话”。

4 EVSs在肿瘤中的作用

4.1 肿瘤-基质细胞的“对话”

肿瘤EVSs改变了局部的或募集到的基质细胞，产生有利于肿瘤生长的微环境，从而支持肿瘤血管生成、免疫抑制和肿瘤细胞获得恶性表征。肿瘤衍生的EVSs可以抑制CD8+细胞的增殖和活化，同时促進调节性T细胞的扩增。除了它们对适应性免疫系统的作用之外，肿瘤EVSs还可以将先天免疫成分“教育”为致癌表型。例如，肿瘤EVSs表面上的Hsp72通过TLR2依赖性机制诱导IL-6/Stat3信号通路来激活骨髓衍生的抑制细胞[15]。Nabet等[16]证实，前列腺癌细胞释放的EVSs触发诱导血管生成的肌成纤维细胞分化并加速体内肿瘤生长，这些效应是由囊泡表面的TGFβ介导的。与这一发现一致的是，Webber等[17]最近发现骨肿瘤细胞释放的EVSs携带高水平的膜相关的TGFβ，通过活化STAT3信号通路，诱导间充质干细胞（MSC）释放IL-6及促进肿瘤的转移，这表明由肿瘤EVSs在肿瘤微环境内启动的炎症环节增强了肿瘤细胞的转移行为。除了对基质细胞的影响外，EVSs还通过作用于细胞外基质有助于肿瘤的进展。Baglio等[18]报道肿瘤外泌体通过分泌纤维连接蛋白增强细胞的定向运动。随后他们又证明了肿瘤外泌体不仅增强细胞迁移速度，而且促进趋化梯度的定向运动，但确切的机制尚不清楚。

4.2 基质-肿瘤细胞的“对话”

肿瘤-基质的交流主要集中在肿瘤EVSs改变基质细胞行为的单向过程。然而，2017年，Feng等[19]研究表明，成纤维细胞衍生的囊泡可激活自分泌的Wnt信号通路，从而增强肿瘤细胞的运动和转移。从那以后，有研究表明基质EVSs控制着肿瘤进展的多个方面，包括获得侵袭性的表型，耐药等，如：Nabet等[16]研究表明，在母体细胞内，pol-Ⅲ转录物主要与RNA结合成伴侣，这些伴侣阻止它们被细胞内传感器识别。在特定条件下，可以将这些RNA分子整合到外泌体中，并在传送到受体细胞时激活模式识别受体（PRR）和刺激相关基因（ISG）表达。Godlewski等[20]的研究表明，这种机制与促进肿瘤进展的肿瘤-基质通讯密切相关。Zhang等[21]的研究进一步证实了EVSs相关RNA在基质-肿瘤通讯中的作用。其结果表明，人类乳腺癌细胞在播散到大脑时下调基质细胞的肿瘤抑制基因PTEN表达，但这种情况不会出现在其他转移部位;进一步体内实验证明星形胶质细胞来源的EVSs通过转移miRNA-19a，可下调肿瘤细胞PTEN的表达。这项研究再次确认了基质EVSs在肿瘤细胞与宿主环境之间的作用。未来的研究应该旨在了解这种模型是否可以扩展到其他器官转移灶形成的研究。最近发现基于线粒体DNA转移的一种新型的EVSs通讯方式与耐药性有关。有研究[9，22-23]发现肿瘤相关的成纤维细胞衍生的EVSs，可恢复激素疗法诱导的乳腺癌干细胞的休眠和对激素疗法的抵抗。这项原创工作提出了多个问题：哪个EVSs子类负责线粒体基因组的转移？线粒体DNA如何并入EVSs？最重要的是，线粒体DNA如何在功能上转移到正确的亚细胞位置并恢复受体细胞的代谢活性？虽然许多方面需要进一步明确，但这项研究揭示了一种新型的肿瘤代谢通讯方式。

5 結语

肿瘤的生长、侵袭和转移依赖于肿瘤细胞与其所处微环境中基质细胞的“交叉对话”，这种“交叉对话”主要涉及这两种细胞的可溶因子的分泌、膜包囊颗粒的释放以及细胞与细胞间的直接接触。EVSs在这种交叉对话中起重要作用。EVSs通过不同的分选机制将蛋白质、DNA、RNA分选入EVSs体内。EVSs体内携带的这些物质可以促进肿瘤细胞的生长，促进新生血管的生成，进行间质细胞间的转化，可以利用肿瘤的微环境为其转移提供必要条件。目前，干扰EVSs的产生，货物装载和/或功能。这是不易的，因为正如本综述中所描述的那样，存在多种可能的机制，并且对EVSs亚群的性质和功能还不是很清楚。不过，随着对EVSs各种机制研究的不断深入，EVSs将更好地满足临床治疗需求，开发肿瘤治疗新手段。

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