基于黄褐棉导入系的棉花衣分QTL定位研究

陈 奇，周水娟，孙康泰，刘 静，袁宝童，王议萍，王 为，王有武，汪保华，庄智敏*

(1.南通大学生命科学学院，江苏 南通 226019；2.江苏沿海地区农业科学研究所，江苏 盐城 224002；3.塔里木大学植物科学学院，新疆 阿拉尔 843300)

【研究意义】棉花是世界上首选的也是最重要的纺织纤维原材料，其产量的提高对推动世界经济和纺织工业的发展起着重要作用，进而可有力地改善了人民生活水平。籽棉产量和皮棉产量是棉花产量的两种主要衡量指标，而单株铃数、单铃重、衣分则是皮棉产量的三个主要组成要素，其中衣分在产量育种的选择中占据重要地位[1]，在各因素中具有最高的遗传率[2]。因此，定位棉花中衣分相关的数量性状位点，可对棉花的产量研究做出贡献。【前人研究进展】近年来，分子标记辅助育种(Molecular Marker Assisted Selection，MAS)技术不断发展，已广泛应用于各种种质研究中，并将发挥出越来越大的作用[3]。SSR分子标记是最常用的分子标记技术之一，而且它已经被用于棉花育种许多年，并取得了许多成果，通过构建相关遗传图谱，在DNA水平上对相应数量性状基因座(Quantitative Trait Locus, QTL)的数目、位置、效应以及QTL与QTL间、QTL与环境的互作、QTL的一因多效性等展开研究，结合表型性状能直观反应作物的遗传多样性[4]。导入系(Introgression lines，ILs)，又称染色体片段代换系(Chromosome segments substitution lines)，可简要理解为用供体亲本的染色体片段去替换受体亲本的相应位置片段[5]，该过程可通过自交和回交相结合的方式来构建目的群体。染色体片段导入系可以定向改良棉花产量性状，其关键在于能对复杂的产量性状进行定位。迄今为止，研究者已在包括水稻、玉米、番茄、油菜等一些作物的染色体片段导入系中进行过QTL详细定位研究[6-10]。而所谓的QTL定位，就是定位基因在染色体上的位置。为了棉花的基因组研究和分子育种，早在十多年前，国外就已经开展了QTL定位在棉花育种中的研究，许多研究团队已经绘制过产量和产量构成因子性状的QTL[11]。石玉真等[12]利用主效纤维QTL的分子标记辅助选择明显地改善了棉花纤维强度，加快了棉花纤维品质的育种进程。然而，他们使用的绝大多数分离群体是暂时性群体，由于低遗传性和高实验误差是影响数量性状鉴定的主要因素，构建永久性的群体来解决这些问题是一种有效的方法。重组自交系(RILs)群体以及导入系群永久性群体在植物育种和遗传研究中非常有用[13-14]。【本研究切入点】四倍体棉花栽培种主要有2个：陆地棉(GossypiumhirsutumL.)以及海岛棉(GossypiumbarbadenseL.)，其中陆地棉是更为广泛的栽培棉[15-16]。黄褐棉是起源于巴西的四倍体野生棉，与陆地棉遗传距离相距甚远，必然具备一些新的有用的基因位点，若能将其导入到陆地棉中，可能会对栽培品种的改良有重要意义。Tanksley和Nelson提出的回交高世代QTL(Advanced backcross QTL，AB-QTL)分析法可将野生种的优良主效基因导入到常规栽培种中，并能很好地解决在引入有利基因时产生的连锁累赘问题[17]。【拟解决的关键问题】本研究拟利用野生棉资源来拓宽陆地棉遗传多样性，以黄褐棉与陆地棉杂交并回交构建的导入系群体为材料，开展SSR分子标记实验，结合衣分表型性状调查，鉴定衣分QTL，以期服务于后续的棉花分子育种。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验以常规栽培棉陆地棉PD94042为受体亲本(P1)，以野生棉黄褐棉(G.mustelinum)为供体亲本(P2)杂交，杂交后代与陆地棉轮回亲本回交，通过多次回交构建出高世代回交群体[18]。从中选育出一套渗透有黄褐棉染色体片段的导入系群体(共计65份材料)并置于2个环境(2011与2012年)下进行重复实验。

1.2 实验方法

本次研究中的棉花叶片DNA的提取采用CTAB法[19]，并根据具体情况作了相应的改良，提取后的DNA采用1 %的琼脂糖电泳检测其浓度及分子量，或者使用紫外分光光度计检测DNA的纯度与浓度，OD260/OD280值在1.7～1.9 范围内为合适。SSR分子标记包括PCR反应体系的建立和扩增、产物的分离、基因型的分析等步骤。实验过程中标记出并记录所得数据。

1.3 数据统计及分析

实验通过聚丙烯酰胺凝胶电泳来进行群体基因型统计，根据清楚的显示条带结果，然后依据DNA Ladder标准，记录所用SSR标记的类型，将每个引物所标记的数据输入Excel表格。在整个实验过程中仔细记录各个时间段的田间表型数据，输入Excel表格，并进行相应的统计分析，计算其衣分相关值，包括平均值、范围、变异系数、偏度等，并制作柱状分布图。

综合导入系群体的基因型数据，用MAPMAKER/EXP 3.0软件分析各标记之间的连锁关系，选用Kosambi函数，LOD值设为3，最大交换距离为40 cM，构建分子标记的遗传连锁图谱；结合田间表型数据，利用WinQTLCart2.5软件开展基于黄褐棉导入系的衣分QTL定位，检测QTL最低LOD值为3。

2 结果与分析

2.1 衣分表型分析

如表1所示，2011年的衣分(LP11)平均值为34.88，亲本衣分小于群体平均值；导入系群体的衣分变化范围是17.58～41.60，数据变异程度不是很高，但偏度绝对值较高。2012年的衣分(LP12)平均值为36.23，亲本衣分大于群体平均值；导入系群体的衣分变化范围是18.98～41.81，数据变异程度较大，偏度绝对值较高。

表1 黄褐棉导入系群体衣分统计分析

图1 导入系群体衣分表型分布Fig.1 Phenotypic distribution of lint percentage in the IL population

导入系群体的衣分分布如图1所示，根据结果统计可以看出该导入系群体中存在来自于黄褐棉的与衣分相关的渐渗片段，对群体衣分的提高具有一定的促进作用。

2.2 遗传连锁图与衣分QTL分析

综合导入系群体的表型数据和基因型数据，构建衣分性状的遗传连锁图谱。本实验采用复合区间作图，检测某一特定的标记区间，将该特定标记与其他QTL连锁的标记也拟合在模型中，控制背景遗传效应[20]。

由表2可以看出，共检测到21个衣分QTLs，它们的LOD值均大于3；解释的表型方差从19.3 %(qLP-2-1)到42 %(qLP-19-1)。根据加性效应可知，共有9个QTL，即qLP-2-1、qLP-3-1、qLP-5-1、qLP-11-2、qLP-19-1、qLP-19-2、qLP-22-1、qLP-23-1、qLP-26-1的衣分增效基因来自于黄褐棉。位于3号染色体上的qLP-3-1在两个环境下都能检测到；5号染色体上的qLP-5-1、11号染色体上的qLP-11-2以及位于19号染色体上的qLP-19-1，它们的LOD值大于7；这4个QTL的衣分增效基因均来自黄褐棉，即黄褐棉具有提高衣分的作用，有必要进一步开展深入研究，可以作为后续精细定位以及优良导入系选择基础的重点内容。

表2 导入系群体衣分QTL定位结果

3 讨 论

作物的大部分农艺性状由多基因控制，但每个基因只能表现出微效的作用，而且环境对作物表型的影响相对较大，因此用传统的育种方法进行性状选择会造成较大的偏差。随着DNA分子标记技术在遗传图谱构建中的广泛应用，许多研究者提出利用分子标记辅助选择的方法来改良数量性状，比利时人Peleman和vander Voort[21]在2003年提出构建大量的染色体片段导入系的分子设计新型育种方法，极大地推动了分子育种的进程。Kohel早在1977年就利用陆地棉TM-1、海岛棉3-79杂交，培育了6个单片段代换系材料[22]。在作物中也报道了通过分子标记辅助选择和高世代回交相结合的方法来获得染色体渐渗片段，包括棉花[23]、大豆[24]、水稻[25]等。在前人的众多研究中，极少有使用黄褐棉染色体片段渐渗系的报道，本研究使用野生棉黄褐棉作为亲本材料之一，黄褐棉作为与陆地棉遗传距离最远的异源四倍体野生棉，很可能具备一些优异的基因位点，如能将其导入到栽培种陆地棉中，可对改良现有陆地棉栽培种做出重大贡献。

衣分是棉花产量的重要组分之一，在陆地棉众多的产量构成因子中具有最高的遗传率，许多研究者都已做过大量研究。张建[26]等利用陆海重组自交系群体，共鉴定到12个影响衣分的QTL，解释表型变异率为3.5 %～21.2 %。Guo等[27]利用陆地棉的重组自交系群体检测到6个衣分相关的QTL。Li等[28]利用陆地棉组合F2:3群体检测到1个衣分相关的QTL。孔广超[29]等利用永久性陆地棉RIL群体在4种环境下共检测到6个与衣分相关的、具有较高贡献率的QTL。

本研究以黄褐棉染色体片段替换系为材料，在2011和2012两个不同环境中，共鉴定到21个影响衣分的QTL，它们大多离散地分布在多条染色体上，解释表型变异率为19.3 %～42 %，加性效应在4.75～6.40。同一性状的QTL在不同定位群体中的表现不一致，同一群体的QTL检测结果也会因环境等因素的不同而有差异；位于3号染色体上的QTLqLP-3-1在两个环境中均检测到，表现出不依赖于环境的稳定性。位于19号染色体上的qLP-19-1贡献率高且LOD值最大，可以作为后续研究的重点内容，开展精细定位甚至图位克隆。朱亚娟[30]等利用海岛棉染色体片段导入系鉴定到位于15号染色体上的QTL，与所检测到的qLP-15-1可能具有一定的关联；同时，位于3号染色体上的QTLqLP-3-1与25号染色体上的qLP-25-1可能与Guo[29]等在同一条染色体上检测到的衣分QTL通过共性标记建立联系；Zhang[31]等利用基于陆地棉的重组自交系群体鉴定到位于5号染色体上的qLP-5-1和18号染色体上qLP-18-1，本研究中也有相应染色体的QTL。

4 结 论

本研究鉴定出的衣分 QTLs 大多都具有较高的贡献率，在棉花产量的分子设计育种方面具有一定的应用前景。在接下来的研究中，可以用含有贡献率较大QTL的导入系材料为供体亲本，与陆地棉品种进行杂交与回交，开展精细定位，加快棉花产量的分子育种进程。