锯叶棕浆果油体外抗脂质过氧化效果研究

黄秋伟　毛立彦　龙凌云　唐毓玮　梁惠　黄秋艳

摘 要：以超临界萃取得到的锯叶棕果油为研究材料，采用卵磷脂脂质过氧化体系研究锯叶棕果油的抗脂质过氧化能力，并对反应体系进行了优化。试验结果表明，在卵磷脂浓度5 mmol/L、硫酸亚铁浓度20 mmol/L、水浴时间15 min的试验条件下，锯叶棕果油能够明显的抑制蛋黄卵磷脂的过氧化进程，且低浓度的抑制效果高于高浓度的，当果油浓度为1.0 mg/mL时，过氧化抑制率为73.92 %。为锯叶棕进一步的开发利用提供了理论依据。

关键词：锯叶棕果油 脂质过氧化 抑制作用

Abstract：The fruit oil of saw palmetto extracted by supercritical carbon dioxide was used as study material. The anti-lipid peroxidation ability of saw palmetto fruit oil was studied by using lecithin lipid peroxidation system， and the system was optimized. The test results indicated that saw palmetto fruit oil showed significant inhibition of lipid peroxidation under the experimental conditions of lecithin concentration 5 mmol/L， ferrous sulfate concentration 20 mmol/L and water bath time 15 min. The low concentration of fruit oil performed better than high concentration of fruit oil. The inhibition rate of lipid peroxidation reached 73.92 % when the concentration of fruit oil was 1.0 mg/mL. The results provide a theoretical basis for the further development and utilization of saw palmetto.

Key words：Saw palmetto fruit oil;lipid peroxidation;inhibitory effect

鋸叶棕（Saw palmetto）属棕榈科灌木植物，其果实为核果类的浆果。锯叶棕果实中除含有丰富的油酸、亚油酸、亚麻酸等脂肪酸成分外，还含有一些碳水化合物及挥发性成分[1]。我国缺少野生锯叶棕资源，只有热带的几个省份如广西、广东、海南等地有关于锯叶棕引种适应性的调查报道[2-4]，因此受限于资源的分布，国内关于锯叶棕方面的研究较少。当前国内关于锯叶棕的研究，主要关于果实提取物治疗前列腺肥大症和抗肿瘤等[5-7]方面的内容，且研究材料均是来自国外研制好的成品药。此外，由于国内资源较少，针对于锯叶棕果实内含物提取的研究也只是有少量的报道，且提取方式主要是有机溶剂回流提取和超临界二氧化碳萃取2种[8-9]，而关于锯叶棕果提取物的抗氧化活性研究却没有。

抗氧化活性的评价方法有体外抗氧化和体内抗氧化2种，体外抗氧化主要方式就是在生物体外，模拟自由基的生成，通过加入抗氧化剂后，自由基的生成受到抑制或者多余的自由基被清除。生物体内过多的自由基引起的氧化作用往往会导致人体疾病如肿瘤、血管硬化和衰老的发生。脂质过氧化就是一个典型活性氧参与的自由基链式反应。当前体外防止脂质过氧化模型因不同的氧化底物而分为几大类，主要研究报道[10-14]的有磷脂脂蛋白、油酸及亚油酸、小鼠肝脏匀浆、小鼠红细胞等4个脂质抗氧化模型。虽然利用这些脂质抗氧化体系测定有效成分的抗氧化活性的研究报道较多，但是这些报道大多是在现有的研究文献中调整条件参数后，就开始进行试验，而针对于所选用的体系条件的优化研究报道极少，关于磷脂过氧化体系条件摸索则更少，目前所查到的文献主要是关于Fe2+浓度对启动蛋黄磷脂脂质过氧化反应的影响[15]。本次试验主要是采用磷脂脂蛋白脂质抗氧化模型，研究锯叶棕果油的抗脂质过氧化作用，为锯叶棕进一步的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

锯叶棕果油：锯叶棕果实采摘于广西壮族自治区亚热带作物研究所种质资源圃，预处理之后，并经超临界流体萃取后得到;CO2气体（食品级，纯度≥99.9 %）：广西国信气体研究院有限公司;蛋黄卵磷脂（BR级）：上海源叶生物科技有限公司;硫代巴比妥酸（TBA）：上海源叶生物科技有限公司;七水硫酸亚铁：国药集团化学试剂有限公司;三氯乙酸（TCA）：天津市大茂化学试剂厂;磷酸氢二钠、磷酸二氢钠：广东光华科技股份有限公司;无水乙醇（AR级）：成都市科隆化学品有限公司。

1.1.2 试验设备

HA221-40型超临界流体萃取装置：南通市华安超临界萃取有限公司;GR200型电子分析天平：日本A&D有限公司; DHG-9109A型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司;QE-300型中药材高速粉碎机：武义屹立工具有限公司;MJ33型快速水分测定仪：梅特勒-托利多公司;HH-S4型数显示恒温水浴锅：金坛市医疗仪器厂;3-30K高速冷冻离心机：德国SIGMA公司。

1.2 试验方法

1.2.1 Fe2+催化蛋黄卵磷脂过氧化反应条件的筛选

1.2.1.1 蛋黄卵磷脂浓度的选择

先用无水乙醇作溶剂，配制10 mmol/L蛋黄卵磷脂溶液作为稀释母液。依次量取一定量的母液至10 mL容量瓶中并用无水乙醇定容，配成1、2.5、5、7.5、10 mmol/L的卵磷脂浓度液，每个浓度液各吸取0.2 mL置于5支试管中，然后往5支试管中依次加入无水乙醇溶液0.2 mL、10 mmol/L硫酸亚铁溶液0.2 mL，最后加入0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）补至2.0 mL。液体混合均匀后，置于37℃水浴反应10 min，反应完后取出加20 %TCA溶液1.0 mL，混匀静置5 min，再加入0.8 %TBA 1.0 mL，混匀，沸水浴10 min后，快速放入冷水中冷却，8000 r/min、4℃条件下离心15 min，取上清液在波长532 nm处测定吸光度。比较不同浓度的蛋黄卵磷脂对吸光值的影响。

1.2.1.2 Fe2+催化剂浓度的选择

先配制50 mmol/L的硫酸亚铁母液，依次量取一定量母液至10 mL容量瓶中并加水稀释定容，配置成5、10、15、20、25 mmol/L的硫酸亚铁浓度液。取5支试管，往每支试管中先加入2.5 mmol/L卵磷脂溶液0.2 mL、无水乙醇溶液0.2 mL，然后吸取各个硫酸亚铁浓度液0.2 mL，最后用0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.4）补齐体积至2.0 mL。液体混合均匀后，置于37℃水浴反应10 min，反应完后取出加20 %TCA溶液1.0 mL，混匀静置5 min，再加入0.8 %TBA 1.0 mL，混匀，沸水浴10 min后，快速放入冷水中冷却，8000 r / min、4℃条件下离心 15  min，取上清液在波长532 nm处测定吸光度。比较反应体系加入不同浓度的硫酸亚铁对吸光值的影响。

1.2.1.3 水浴反应时间的选择

取5支试管，每支试管依次加入2.5 mmol/L卵磷脂溶液0.2 mL、无水乙醇溶液0.2 mL 、10 mmol/L硫酸亚铁溶液0.2 mL，用0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.4）补齐体积至2.0 mL。液体混匀后，置于37℃水浴反应，反应时间设置5、10、15、20、25 min这5个梯度，每支试管对应1个梯度。反应时间到后，取出加20 % TCA溶液1.0 mL，混匀静置5 min，再加入0.8 %TBA 1.0 mL，混匀，沸水浴10 min后，快速放入冷水中冷却，8000 r / min、4℃条件下离心 15 min，取上清液在波长532 nm处测定吸光度。比较不同浓度的水浴反应时间对吸光值的影响。

1.2.2 锯叶棕果油抗脂质测定试验

先以无水乙醇作为溶剂，吐温80作为乳化剂，将锯叶棕果油配制成1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL的果油浓度稀释液。取7支试管，6支试管各加入相应果油浓度稀释液0.2 mL，剩余的1支试管加入无水乙醇溶剂0.2 mL作为空白对照。按照1.2.1筛选优化的反应条件進行加样和水浴反应，之后取出加20 %TCA溶液1.0 mL，混匀静置5 min，再加入0.8 %TBA 1.0 mL，混匀，沸水浴10 min后，快速放入冷水中冷却，8000 r / min、4℃条件下离心 15 min，取上清液在波长532 nm处测定吸光度。空白对照管吸光值记为A0，样品管吸光值记为A1，并按照下式来计算MDA抑制率。

MDA抑制率（ % ） = [（ A0-A1） /A0]× 100

2 结果与分析

2.1 卵磷脂脂质过氧化反应条件的筛选

2.1.1 蛋黄卵磷脂浓度的选择

在固定铁离子催化剂浓度10 mmol/L和水浴反应时间10 min，所设置的5个卵磷脂浓度梯度对整个过氧化体系的MDA生成影响如图1所示。

从图1可以吸光值随着卵磷脂浓度的提高而不断升高，且每个浓度梯度的吸光值存在着显著性差异。当卵磷脂浓度低于5 mmol/L时，脂质过氧化程度较低，MDA的生成量较少，2.5 mmol/L的卵磷脂浓度所表现出的吸光值只有0.277，当浓度为5 mmol/L时，吸光值已经达到0.646，浓度再往7.5 mmol/L提高时，吸光值已经超过0.800。依据朗伯-比尔定律，吸光值与样品浓度的线性关系有效OD值范围一般是在0.200～0.800之间，数值超过1.000则会出现较大误差。为了保证减少试验误差，先选取吸光值在上述OD值范围内的浓度值。在此基础上，为了确保添加果油后所产生抑制效果的吸光值不宜过低，因此选取吸光值在0.500～0.800的浓度值作为抗脂质过氧化反应体系的底物浓度。本次试验，选取卵磷脂浓度为5 mmol/L作为后续抗氧化试验的底物浓度。

2.1.2 铁离子催化剂浓度的选择

在固定蛋黄卵磷脂底物浓度2.5 mmol/L和水浴反应时间10 min，所设置的5个铁离子浓度梯度对整个过氧化体系的MDA生成影响如图2所示。

由图2可以看出，硫酸亚铁的浓度越高，吸光值也随之显著升高，表明了金属离子催化剂浓度越高，卵磷脂脂质过氧化程度越激烈。当硫酸亚铁浓度低于20 mmol/L时，脂质过氧化程度较低，MDA的生成量较少，15 mmol/L的卵磷脂浓度所表现出的吸光值只有0.458，当浓度为20 mmol/L时，吸光值为0.646，而浓度升至25 mmol/L时吸光值为1.029，吸光值已经超过1.000。因此，综合朗伯-比尔定律及试验结果分析，选取20 mmol/L硫酸亚铁来进行下一步的抗脂质过氧化试验。

2.1.3 水浴反应时间的选择

在固定蛋黄卵磷脂浓度2.5 mmol/L和铁离子催化剂浓度10 mmol/L，所设置的5个水浴反应时间梯度对整个过氧化体系的MDA生成影响如图3所示。

从图3可以看出吸光值随着水浴时间的增加而不断升高，且每个时间梯度的吸光值存在着显著性差异。当水浴时间低于15 min时，脂质过氧化程度较低，10 min的水浴时间所表现出的吸光值只有0.251，当浓度为15 min时，吸光值为0.596，而浓度再增加至20 min时，吸光值为0.805，吸光值已经超过0.800。因此，综合朗伯-比尔定律及试验结果分析，选取15 min的水浴时间来进行下一步的抗脂质过氧化试验。

2.2 锯叶棕果油抑制卵磷脂过氧化的结果

根据2.1优化结果，选取卵磷脂浓度5 mmol/L、硫酸亚铁浓度20 mmol/L、水浴时间15 min的试验条件进行不同浓度梯度的锯叶棕果油对抑制蛋黄卵磷脂过氧化效果试验，反应中MDA的生成效果如图4。

由图4可知，锯叶棕果油对卵磷脂过氧化的有抑制活性，且抑制率随着果油浓度的提高而表现出了一种整体下降的规律性。当果油浓度为1.0 mg/mL时，因脂质过氧化反应所产生的吸光值只有0.161，与不加果油的空白对照产生的吸光值0.616相比，表现出了明显的抑制效果，过氧化抑制率为73.92 %，此时的抑制率达到最高。之后随着浓度的提高，抑制率呈现出下降的趋势，且高浓度与高浓度的下降差异表现出了显著性，这表现为果油浓度由8.0 mg/mL升高至10.0 mg/mL时，相应的抑制率从69.21 %下降至65.96 %。出现下降的原因可能是由于锯叶棕果油中含有大量的硬脂酸和亚油酸，这两者本身可被金属离子催化产生自由基，进一步过氧化生成MDA，而导致吸光值变大，过氧化抑制率下降，高浓度的果油中硬脂酸及亚油酸就越多，在此基础上越提高果油浓度，就相当于增加了脂质过氧化体系中的底物浓度，过氧化程度越高，过氧化抑制率下降就越来越明显。

3 结论

本次研究先对蛋黄卵磷脂的脂质过氧化反应条件进行了筛选试验，主要考察底物浓度、Fe2+离子催化剂浓度、水浴反应时间这三者对脂质过氧化产物（MDA）生成率的影响。从筛选试验结果中，确定后续果油抗氧化试验的反应条件，即蛋黄卵磷脂浓度5 mmol/L、硫酸亚铁浓度20 mmol/L、水浴反应时间15 min。在此反应条件下，锯叶棕果油表现出了较强的脂质过氧化抑制能力，且该抑制力随着果油浓度的升高而降低，果油浓度为1.0 mg/mL时，过氧化抑制率可达到73.92 %。本次研究结果表明锯叶棕果油对于脂质过氧化有着很好的抗氧化活性，浓度越低，活性越好，这为后期锯叶棕果油进一步开发利用提供了依据。

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