鲜切柠檬壳聚糖复合保鲜涂膜配方优化

许青莲，李少华,2，税玉儒，杨华,3，李宣林，林洪斌*，邢亚阁

1(西华大学 食品与生物工程学院，四川 成都，610039)2(威远县市场监督管理局，四川 内江，642450)3(宜宾西华大学研究院，食品非热技术重点实验室，食品非热工程技术研究中心，四川 宜宾，644004)

柠檬(Citruslimon)属芸香科柑橘属常绿小乔木，鲜果含有类黄酮、香豆素类等多种活性成分，具有降血压、降血脂、抗氧化等功效[1-2]。四川安岳柠檬种植规模大、产量多[3]。柠檬是非呼吸跃变型果实，在运输中可能会发生果蒂脱落、因运输温度太高而腐烂、贮藏时因CO2浓度不当而果实变味等现象[4]。针对上述易出现的问题，国内外学者研发多种柠檬贮藏保鲜技术，如低温保鲜、气调保鲜、留树保鲜、涂膜保鲜等[5]。其中，壳聚糖精油的复合涂膜保鲜技术能够抑制微生物生长和繁殖、控制果实腐烂，延长果蔬货架期[6-8]。

目前，复合涂膜保鲜技术发展迅速，保鲜效果明显。LIU等[9]研究发现壳聚糖-氯化钙-抗坏血酸复合涂膜能有效抑制鲜切苹果褐变及维持其硬度；邢亚阁等[10]发现壳聚糖/纳米TiO2复合涂膜对金黄色葡萄球菌抑菌效果较好。但是，壳聚糖复合涂膜保鲜液在柠檬方面的应用较少，刘清化等[11]研究发现壳聚糖与茶多酚对柠檬保鲜均有较好效果，但未深一步研究两者共同作用对柠檬的保鲜效果。本文以壳聚糖为基质，添加抗褐变剂和植物精油制备成复合涂膜保鲜液应用于鲜切柠檬片，并优化研究了最佳涂膜液配方。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

尤力克柠檬(Limoncv.Eureka)，采摘于安岳县龙台镇；壳聚糖(脱乙酰度>90%)，济南海得贝海洋生物有限公司；柠檬酸、抗坏血酸、CaCl2、冰乙酸、蔗糖脂肪酸酯、吐温80(均为食品级)，郑州市福泰程化工产品有限公司；丁香精油、肉桂精油，徐州艾佩斯商贸有限公司。

1.2 主要仪器设备

乳化剪切机、SH-3加热磁力搅拌器，天津市泰斯特仪器有限公司；WF 32型手持色差仪，深圳威福光电科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品预处理

选取成熟新鲜、大小均匀、无病虫害和机械损伤的柠檬整果，去头去尾后留取中间部分并切分成厚度为5～8 mm的薄片，纱布擦去表面汁液，于复合保鲜涂膜液中浸泡2 min，捞出沥干并装盒包装，在不同温度条件下定期测定相关指标。

1.3.2 褐变度测定

参考祖鹤[12]的方法，称取柠檬鲜切片果肉1.0 g，加入10 mL去离子水研磨匀浆后，4 ℃，6 000 r/min离心10 min，取上清液在410 nm下测定吸光度值A410，褐变度(BD)=10×A410。

1.3.3 色差测定

用色差仪测定鲜切柠檬片混合样色度[12]，每个处理测定3个样品，每个样品测定3次。结果L、a、b采用公式(1)、(2)计算色差ΔE与ΔE′(ΔE越大处理效果越好；ΔE′越小处理效果越好)：

(1)

(2)

式中：ΔL，样品处理组L与空白处理组L差值；Δa，样品处理组a与空白处理组a差值；Δb，样品处理组b与空白处理组b差值；ΔL′，样品处理组贮藏8 d后L与初始L差值；Δa′，样品处理组贮藏8 d后a与初始a差值；Δb′，样品处理组贮藏8 d后b与初始b差值。

1.3.4 涂膜保鲜剂制备

分别取一定量的壳聚糖(1.00%)溶于含有0.5%乙酸的250 mL蒸馏水中[7,13]，室温下磁力搅拌10 min后至完全溶解，加入抗褐变剂(0.5% CaCl2)，室温搅拌10 min至完全溶解，加入乳化剂(0.1%蔗糖脂肪酸酯)完全溶解后再加入精油(0.1%丁香精油)，剪切速率为10 000 r/min，剪切时间为15 s，得到的溶液低温避光平衡1 h备用。

1.3.5 涂膜保鲜剂单因素实验

壳聚糖浓度设为0.5%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%；抗褐变剂CaCl2、抗坏血酸、柠檬酸浓度均设为0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%；抗菌成分丁香、肉桂精油浓度均设为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%；乳化剂吐温-80、蔗糖脂肪酸酯浓度均设为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%。上述各处理均以蒸馏水代替保鲜液作为空白组，每隔1 d测定褐变度与色差ΔE进行评价。

1.3.6 涂膜保鲜剂响应面试验设计

以单因素实验为基础，继续优化复合涂膜保鲜液配方，选择壳聚糖、CaCl2、丁香精油、蔗糖脂肪酸酯设计四因素三水平的BBD响应面试验。对照组采用蒸馏水浸泡2 min，将处理后的柠檬片捞出控干表面水分进行装盒包装，(0±0.5)℃贮藏。以褐变度、色差ΔE′为响应值来优化得出最佳涂膜配方。

1.3.7 数据处理

实验数据由SPSS 22.0、Design Expert 9.0软件分析处理。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 不同温度下鲜切涂膜柠檬片褐变度的测定

鲜切涂膜柠檬片褐变度随着贮藏时间而增加，且不同贮藏温度褐变度变化程度不同。如图1、图2所示，10 ℃贮藏条件下，鲜切涂膜柠檬片褐变度始终最大，贮藏6 d后褐变度值为1.67，第8天时柠檬片出现腐败变质不可继续贮藏。0 ℃贮藏6 d时与其他温度贮藏褐变度差异显著(P<0.05)，褐变度值为1.18，囊衣出现轻微变黄，可能是因为柠檬汁液的渗出。贮藏到10 d时，0与4、7 ℃差异极显著(P<0.01)，4 ℃和7 ℃无显著性差异(P>0.05)，3个温度的褐变度值分别达到1.81、2.2、2.3。低温0 ℃和冷藏4 ℃能够有效抑制氧化过程形成醌类物质，能有效控制鲜切涂膜柠檬片贮藏过程中褐变度[14]。

图2 不同贮藏天数对鲜切柠檬片的影响Fig.2 Appearance image of fresh-cut lemon after coated with composite membrane liquid at different storage days

2.1.2 不同浓度壳聚糖对鲜切柠檬片褐变的影响

壳聚糖具有阻水性、选择透气性，能在柠檬表面成膜防止水分散失，给柠檬创造稳定的湿度环境[15-16]。通过不同浓度壳聚糖制备保鲜液探究鲜切柠檬在低温贮藏8 d后的褐变情况，如图3所示。壳聚糖浓度小于1.25%时，褐变度随着浓度增加而下降，浓度为1.25%～1.50%时褐变度上升。

图3 壳聚糖浓度对鲜切柠檬片褐变度、色差(ΔE)的影响Fig.3 Effects of concentration of chitosan on browning degree and ΔE of fresh-cut lemon

不同浓度壳聚糖涂膜液贮藏下柠檬色差ΔE随着浓度上升而上升，其中1.25%与1.50%处理后的色差ΔE无显著差异(P>0.05)，表明低浓度膜的透明度较高、透光性好。孙莎[17]研究也表明1.50%壳聚糖制得的复合涂膜透光性能较好，但综合褐变度，添加1.25%壳聚糖制备的保鲜液对鲜切柠檬褐变抑制效果较好。

2.1.3 不同浓度抗褐变度对鲜切柠檬片褐变的影响

不同浓度CaCl2、抗坏血酸和柠檬酸对鲜切柠檬褐变和色差ΔE抑制效果如图4。浓度为0.3%的CaCl2涂膜保鲜液的褐变度最小，色差ΔE最大，褐变抑制效果最佳，这与张小琴[18]和KUKURA[19]研究结果稍有不同，可能是柠檬pH低于水蜜桃和皇冠梨，Ca2+与细胞壁的果胶酸结合度不同，降低褐变与水分散失的程度不同。

a-褐变度；b-色差图4 不同抗褐变剂浓度对鲜切柠檬片褐变度和色差(ΔE)的影响Fig.4 Effects of concentration of anti-browning agent on browning degree and ΔE of fresh-cut lemon

较对照处理组，各浓度抗褐变剂的褐变度均有显著差异(P<0.05)，其中0.3% CaCl2处理组褐变度与其他处理组均差异显著(P<0.05)，其他处理组褐变度间结果不显著(P>0.05)；抗坏血酸褐变度低浓度(0.1%、0.3%)、高浓度(0.9%)与较高浓度(0.5%、0.7%)之间差异显著(P<0.05)，但低浓度与高浓度间无显著性差异(P>0.05)；0.1%柠檬酸的褐变度最低，与0.3%、0.9%柠檬酸褐变度无显著性差异(P>0.05)，但0.1%柠檬酸褐变度与对照组、0.5%、0.7%柠檬酸处理组差异显著(P<0.05)。

不同浓度CaCl2色差ΔE均有显著差异(P<0.05)，其中0.3% CaCl2处理组色差与其他处理组均差异显著(P<0.05)，其他处理组色差ΔE之间结果不显著(P>0.05)；抗坏血酸组色差ΔE在0.1%、0.7%与0.5%、0.9%之间差异显著(P<0.05)；柠檬酸的对照处理组色差ΔE与其他浓度处理组之间差异显著(P<0.05)，但各浓度处理组之间仅0.1%与0.3%差异显著(P<0.05)，色差结果不同可能是由于鲜切柠檬片果肉中本身含有丰富的柠檬酸和抗坏血酸，且含不同浓度柠檬酸、抗坏血酸的保鲜液涂膜后含量分布不均匀，导致作用效果不同。

柠檬酸是一种金属螯合剂，能够有效抑制多酚氧化酶活性[20]，从而有效抑制鲜切柠檬片贮藏后的褐变度。抗坏血酸和柠檬酸是两类常用抗氧化剂，柠檬本身含量较为丰富，LIU等[9]研究发现CaCl2与壳聚糖复合作用对褐变抑制效果更佳，因此，0.3% CaCl2处理效果较好。

2.1.4 不同浓度精油对鲜切柠檬片褐变的影响

在涂膜液中添加不同浓度丁香、肉桂精油确定最适精油种类与浓度，结果如图5所示。

a-褐变度；b-色差图5 不同精油浓度对鲜切柠檬片褐变度和色差的影响Fig.5 Effects of concentration of essential oil on browning degree and ΔE of fresh-cut lemon

空白对照组与各浓度丁香精油、肉桂精油之间褐变度均差异显著(P<0.05)，在各浓度丁香精油处理组中，0.10%与其他浓度组褐变度差异显著(P<0.05)，0.05%与0.15%褐变度差异不显著(P>0.05)，0.20%与0.25%褐变度差异不显著(P>0.05)，0.10%丁香精油处理组褐变度最低，为1.42。但0.05%、0.10%、0.15%肉桂精油处理组贮藏8 d后褐变度与高浓度(0.20%、0.25%)处理组结果之间差异显著(P<0.05)，肉桂精油处理组中褐变度最低值仅为1.83(0.25%肉桂精油)。

空白对照组与各浓度2种精油处理组色差值之间均差异显著(P<0.05)，不同浓度丁香精油处理组的色差ΔE最大为1.1(浓度为0.20%)，0.10%色差ΔE与0.05%、0.20%之间差异显著(P<0.05)。而肉桂精油低浓度(0.05%、0.10%)处理组色差与其他3个浓度处理组色差ΔE结果之间差异显著(P<0.05)。肉桂精油较空白处理组色差ΔE最大仅为0.8(肉桂浓度0.25%)。

由于精油浓度香气浓郁，柠檬鲜切后本身气味散失，为保持柠檬特殊风味，仅添加少量精油可抑制贮藏过程中微生物增长，丁香精油中的主要抑菌活性物质是丁香酚[21]。综上，0.1%丁香精油较符合。

2.1.5 不同浓度乳化剂对鲜切柠檬片褐变的影响

聚山梨酯-80(又称吐温-80)和蔗糖脂肪酸酯(简称蔗糖酯)是广泛应用于涂膜材料中的乳化分散剂，能够促进混合保鲜液体系的稳定性、均匀性。在壳聚糖复合涂膜保鲜液中添加不同浓度吐温-80和蔗糖酯来确定最佳种类和浓度，结果如图6所示。

a-褐变度；b-色差图6 不同乳化剂浓度对鲜切柠檬片褐变度和色差的影响Fig.6 Effects of concentration of ascorbic acid on browning degree and ΔE of fresh-cut lemon

不同浓度吐温-80、蔗糖酯保鲜液处理的鲜切柠檬贮藏8 d后的褐变度变化不一，其中浓度为0.10%的蔗糖酯的抑制效果较好，褐变度值为1.57，且与其他浓度处理组褐变度结果差异显著(P<0.05)。吐温-80处理后的褐变度较空白对照组均下降，其中0.20%吐温-80褐变度值最低为1.67，褐变度也略大于0.10%蔗糖酯处理组。在乳化剂浓度大于0.20%时，鲜切柠檬褐变度随浓度增加而上升，其可能原因是乳化剂的加入使保鲜液体系更加稳定，膜的阻水性随乳化剂浓度增大呈现出先增大后降低趋势[22]，在浓度为0.2%时阻水性最佳，影响褐变度呈现出先减小后增大趋势。

蔗糖酯色差ΔE结果在各浓度处理组之间0.05%与0.10%、0.25%差异显著(P<0.05)，0.10%、0.15%、0.20%、0.25%色差ΔE结果之间不存在显著性差异(P>0.05)，0.10%蔗糖酯对应色差ΔE最大为0.85。0.05%吐温-80处理后的色差ΔE与其他处理浓度均具有显著性差异(P<0.05)，而0.10%与0.15%、0.20%、0.25%之间均无显著性差异(P>0.05)，0.15%吐温-80对应色差ΔE最大为0.83，2类乳化剂的色差ΔE与空白组相差最大的为0.10%蔗糖酯。

2.2 响应面结果分析

2.2.1 响应面试验设计

根据单因素实验，选择壳聚糖浓度(A)、CaCl2浓度(B)、丁香精油浓度(C)和蔗糖脂肪酸酯浓度(D)，这4个复合膜主要成分的因素，采用响应面分析，确定4因素对复合膜涂膜鲜切柠檬片贮藏后褐变度和色差ΔE′的影响。中心组合试验设计与结果如表1、表2所示。

表1 Box-Benheken响应面试验设计因素与水平Table 1 Box-Benheken response surface test design factors and levels

运用Design-Expert.V8.0.6软件，设计出4因素水平的响应面试验，共有27组，其中析因点24个，零点3个。3个零点为中心重复试验，用来估算误差。

表2 中心组合试验设计与结果Table 2 Experimental design and results of center combination

2.2.2 褐变度响应面分析

对表2复合涂膜柠檬保鲜后测定褐变度进行多元回归分析，得到褐变度的多元二次响应回归方程(3)：

褐变度=1.55+0.026A-0.057B-0.061C-0.075D+(2.5E-3)AB-0.052AC+0.052AD-(2.5E-3)BC+0.1BD+0.092CD+0.12A2+0.14B2+0.18C2+0.18D2

(3)

由表3可知，模型的F值为7.841，P值为0.000 5，该模型显著，R2为0.901 5，失拟项p=0.105 3>0.05，不显著，模型拟合较好。预测R2为0.786 5，结果一般。CaCl2浓度、丁香精油浓度和蔗糖脂肪酸酯浓度，三者在一次项和二次项中P值均小于0.05，说明这3个因素对复合膜涂膜鲜切柠檬片褐变度均为显著影响。同时，CaCl2与蔗糖脂肪酸酯、丁香精油与蔗糖脂肪酸酯的交互作用显著(P<0.05)。相互作用对褐变度影响显著的响应面三维曲面图和等高线图见图7、图8。

表3 褐变度回归模型方差分析表Table 3 ANOVA for the quadratic polynomial model of browning degree

注：R2=0.901 5,AdjR2=0.786 5,PredR2=0.44,Adeq Precision=11.323。*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001,下同。

图7为壳聚糖和丁香精油固定在零点浓度时，褐变度随着CaCl2和蔗糖酯交互作用的结果。当CaCl2浓度一定时，褐变度随着蔗糖酯浓度增加呈现先降低后升高的趋势；蔗糖酯浓度一定时，褐变度对蔗糖酯浓度变化不明显，两者交互作用不是很明显。从等高线结果看，褐变度最低的CaCl2浓度在0.20%～0.48%，蔗糖酯浓度在0.07%～0.14%。

a-三维图；b-等高线图图7 氯化钙和蔗糖酯交互作用对褐变度的影响Fig.7 Interactive effect of CaCl2 and sugar esters concentration on BD

图8为1.25%壳聚糖和0.30% CaCl2浓度条件下，丁香精油和蔗糖酯浓度的交互作用情况。当丁香精油浓度一定时，褐变度随蔗糖酯浓度增加表现为先降低再增加的趋势，并且蔗糖酯浓度一定时，褐变度变化趋势和丁香精油浓度一定时一致。从等高线结果看，丁香精油浓度在0.07%～0.14%，蔗糖酯浓度在0.07%～0.14%，褐变度最低。

a-三维图；b-等高线图图8 丁香精油和蔗糖酯交互作用对褐变度的影响Fig.8 Interactive effect of clove essential oil and sugar esters concentration on BD

2.2.3 色差响应面分析

对表2复合涂膜柠檬保鲜后测定色差进行多元回归分析，得到色差ΔE′的多元二次响应面回归方程(4)：

ΔE′=0.083-0.06A-0.095B+0.23C-0.19D+0.15AB+0.017AC-0.013AD-0.02BC+0.06BD+0.34CD+0.23A2+0.3B2+1.68C2+0.43D2

(4)

表4 色差ΔE′回归模型方差分析表Table 4 ANOVA for the quadratic polynomial model of ΔE′

注：R2=0.981 9,AdjR2=0.960 8,PredR2=0.896 7,Adeq Precision=20.305。

由表4得知，模拟项P值<0.000 1，模型极显著，R2为0.981 9，失拟项p>0.05，不显著，说明模型拟合较好，性噪比20.305﹥4，即性噪比大于临界值，由此可知模型可行。C、D、CD、A2以及B2的P值均﹤0.05，说明丁香精油和蔗糖脂肪酸酯对鲜切柠檬片涂膜复合保鲜液后色差均影响显著。

图9为丁香精油和蔗糖酯交互作用对色差ΔE′的影响。结果表明，当丁香精油一定时，色差ΔE′随蔗糖酯浓度增加逐渐变小；当蔗糖酯浓度一定时，色差ΔE′随丁香精油浓度的增加表现先降低后升高，表明蔗糖酯与丁香精油浓度交互作用明显，蔗糖酯能够使丁香精油均匀分散在复合涂膜保鲜液中，增加复合膜液的透明度从而降低色差ΔE′。

a-三维图；b-等高线图图9 蔗糖酯和丁香精油交互作用对色差ΔE′的影响Fig.9 Interactive effect of sugar and clove essential oil concentration on ΔE′

2.2.4 响应面试验结果及最佳涂膜保鲜配方验证

运用Design Expert进行分析，确定以褐变度最低，色差ΔE′在可接受范围内为标准，预测出壳聚糖浓度1.23%，CaCl2浓度0.33%，丁香精油浓度0.10%，蔗糖酯浓度0.11%。褐变度为1.54，色差ΔE′为0.050。以预测参数进行验证试验，平行处理3组，将鲜切柠檬片浸泡于复合涂膜保鲜液2 min后捞出、沥干，0 ℃保鲜贮藏8 d后测定褐变度和色差ΔE′。测得复合涂膜保鲜液的柠檬片褐变度为1.50，色差ΔE′为0.054。实际值与预测值差异不显著，模型可靠。

3 结论

通过单因素试验，筛选出壳聚糖、CaCl2、丁香精油和蔗糖酯因素进行四因素三水平的响应面分析法确定最佳涂膜保鲜液配方。以褐变度、色差ΔE′为响应值建立模型，得出回归方程。结果表明，丁香精油和蔗糖酯存在明显的交互作用，对褐变度和色差ΔE′影响均显著(P<0.05)。对2个回归方程进行联合求解，得到褐变度最低，色差ΔE′适宜的复合膜液最佳配方，即壳聚糖浓度1.23%，CaCl2浓度0.30%，丁香精油浓度0.10%，蔗糖酯浓度0.10%。模型预测褐变度和色差ΔE′结果分别为1.55、0.050。最佳配方的实验测定褐变度为1.50，色差ΔE′为0.054。预测值与实际值相对偏差分别为3.3%、7.4%，模型可靠。结论为将复合涂膜保鲜液配方应用于鲜切柠檬片品质保持提供数据与理论依据。