茶园常用除草剂田间药效试验与残留动态

高万君，张永志，童蒙蒙，马慧勤，钱珊珊，王天雨，李叶云，吴慧平*，侯如燕*

茶园常用除草剂田间药效试验与残留动态

高万君1，张永志1，童蒙蒙1，马慧勤2，钱珊珊3，王天雨3，李叶云1，吴慧平2*，侯如燕1*

1. 安徽农业大学茶树生物学及资源利用国家重点实验室，安徽 合肥 230036；2. 安徽农业大学植物保护学院，安徽 合肥 230036；3. 安徽省公众检验研究院有限公司，安徽 合肥 230051

对比评价了草甘膦、草铵膦、复配剂型草甘膦-乙草胺及草甘膦-助剂对茶园主要恶性杂草的防治效果，并对试验小区土壤中各除草剂的残留水平进行了评估。试验结果表明，与草甘膦相比，草铵膦起效快，在施药第7天杂草覆盖度降低到9.15%，施药14 d后对野老鹳、续断菊、小飞蓬等杂草的防治效果在95%以上，草胺磷在茶园土壤中降解较快，30 d的消解率达到94%，残留水平较低（第58天残留量为0.01 mg·kg-1），可能是替代草甘膦除草剂的较优选择；乙草胺作为封闭型除草剂，能够抑制禾本科杂草出苗，且在土壤中消散较快（21 d后的消解率为97%），可用于防治禾本科等杂草。

茶园；除草剂；药效；农药残留

茶树是多年生常绿植物，栽培历史悠久[1]。我国茶树种植区域广阔，茶园生态环境复杂多样，其杂草群落组成复杂、稳定性强。茶园杂草与茶树争夺水分、土壤养分和生长空间，还会助长茶树病虫害的滋生蔓延，危害茶园，给茶树的产量和品质带来不利影响[2-3]。杂草防控是茶园生产管理中一项重要的工作，尤其是幼龄茶园和未封行茶园[4]。人工除草效果较好且不会对茶树产生不利影响，但除草成本高，效率低。近年来，化学除草剂弥补了人工除草工作效率低和劳动力成本高的问题，在农业生产中的使用率呈上升趋势[2-3,5]。长期以来，茶园主要使用的除草剂类型有草甘膦和草铵膦[6]，乙草胺作为封闭剂，20世纪90年代初我国开始引进和生产，可用于芽前防除一年生禾本科杂草和部分阔叶杂草[7-8]。不同类型的除草剂作用机理和环境稳定性不同，部分除草剂性质稳定、持效期长，虽然对杂草的防效期较长，但可能造成土壤板结、茶园生态环境破坏等问题，也可能带来茶叶中农药残留的安全隐患[5]。例如作为世界农药生产量之首的草甘膦，其安全问题近年来备受争议。课题组前期对水培茶苗草甘膦的吸收、转运代谢规律研究发现，作为内吸性除草剂的代表，草甘膦经茶苗根部吸收并转运到叶部，可能是茶叶中草甘膦残留的主要来源[9]。

由于茶树并非除草剂的靶标植物，因此茶园除草剂的使用效果和对茶叶质量安全带来的影响长期以来较少有人关注。我国新颁布的食品中农药残留限量标准（GB 2763—2016）中规定了茶叶中草甘膦和草铵膦的MRLs标准分别为1 mg·kg-1和0.5 mg·kg-1[10]，欧盟制定茶叶中两种农药的MRLs标准为2.0 mg·kg-1和0.1 mg·kg-1。近年来，部分出口茶叶中草甘膦除草剂超标引起了业内的普遍关注，因此筛选评价茶园常用除草剂、研究除草剂在茶园土壤中持留特性及其对茶叶质量安全的潜在影响势在必行，不仅可以辅助人工除草、减少茶园土壤污染，也可保障茶叶质量安全。本文选用常用除草剂草甘膦、草铵膦及其复配剂型草甘膦-乙草胺和草甘膦-助剂，对茶园主要恶性杂草的防效进行了对比评价，并对试验小区内土壤中除草剂残留水平进行了评估。此研究将对茶园杂草的防控提供实践指导，并为茶园除草剂的安全使用和禁限用法规制定，以及替代性农药的选择提供一定的理论和技术参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

商用制剂：含有效成分30%的草甘膦异丙胺盐（中化作物保护品有限公司），含有效成分20%的草铵膦（山东省长清农药厂有限公司），含有效成分90%的乙草胺（浙江天丰生物科学有限公司）。商用助剂：安融乐（现代科技生物助剂，北京成禾佳信农资贸易有限公司）。高效压力溶剂萃取系统（HPSE，莱伯泰科公司）。草甘膦（98.0%）、草铵膦（97.5%）和氨甲基膦酸（99%）标准品购于德国Dr. Ehrensterfer公司。草甘膦内标（草甘膦-2-13C，15N）购于Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司。用纯水配制成1 000 μg·mL-1的单标以及100 μg·mL-1的混标作为标准储备溶液，于4℃冰箱保存。纯水稀释标准储备液配制成不同浓度的标准工作溶液；有证标准物质乙草胺（丙酮配制浓度为100 μg·mL-1）购自北京坛墨质检科技有限公司，丙酮稀释标准储备液成不同浓度水平的标准工作液；衍生化试剂为氯甲酸-9-芴基甲酯（FMOC-Cl）购自阿法埃莎（中国）化学有限公司，并用丙酮配制成20 g·L-1的衍生化溶液，标准工作液及衍生化溶液均需现配现用。硼酸盐缓冲溶液（pH=9）：称取5 g硼酸钠（Na2B4O7·10H2O），用水溶解并定容至100 mL，用5 mol·L-1HCl调pH至9。

1.2 靶标植物

根据课题组前期对茶园杂草的调查研究结果，选择本试验阶段内主要发生4种恶性靶标杂草作为统计对象，包括：花叶滇苦菜[续断菊，(L.) Hill.]、刺儿菜[小蓟，(Willd.) MB.]、野老鹳草（老鹳嘴，L.）和小飞蓬[(L.) Cronq.]。

1.3 试验设计

1.3.1 田间试验

选取安徽农业大学高新技术农业园内的茶园为试验小区，设5个处理组（4次重复），每小区面积约为6 m2，随机排列（图1），各处理小区中间设置隔离行。草甘膦、草铵膦处理组喷施剂量为制剂标签上推荐剂量，草甘膦-乙草胺处理组为推荐剂量的50%，草甘膦-助剂处理组为推荐剂量（具体剂量见表1）。二次稀释法配药，先配成母液再进一步稀释，每公顷兑水量为450~750 kg，采用手持式喷雾器（2.5 L）定量喷雾法均匀进行茎叶喷雾，以清水作为对照。

注：各小区分布，a：草甘膦；b：草铵膦；c：草甘膦+乙草胺；d：草甘膦+助剂；e：对照

1.3.2 防治效果

喷施农药后，每周观察1次，对试验小区内杂草的覆盖度进行评价[11]，并对4种恶性杂草计数，测定其株防效，综合评价除草剂防治效果。考虑到田间试验平行小区间植物生长状态和多样性等存在一定差异，此次试验的株防效是采用所有平行小区内该杂草的总株数进行计算，公式如下：

株防效/%=（处理前平行小区内杂草总株数－处理后平行小区内杂草总株数）/处理前平行小区内杂草总株数×100。

1.3.3 取样

分别于0（喷施农药2 h后待杂草叶面全干记为0 d的样品）、1、3、7、14、21、30、58 d随机抽取各小区土壤样品，取土深度0~15 cm，采样量不少于1 kg，自然风干土壤，混匀后过40目（孔径425 μm）筛，装入封口袋中保存在–20℃冰箱中待测。田间喷施农药后第5天采摘草甘膦处理小区内的茶树新梢测定残留量[9]。

表1 试验小区内药剂喷施剂量

1.4 样品前处理

1.4.1 草甘膦、草铵膦、氨甲基膦酸土壤样品处理

称取干燥土壤样品0.5 g于50 mL离心管中，添加内标1 mg·kg-1，加入10 mL 0.6 mol·L-1的KOH，振荡30 min，4 000 r·min-1离心30 min并过滤得上清液，用6 mol·L-1HCl和0.6 mol·L-1HCl调节上清液pH至7，取1 mL提取液，加入1 mL硼酸盐缓冲液（pH=9）充分混匀，再加入1 mL衍生化试剂进行衍生化反应（不少于12 h）后，10 000 r·min-1离心10 min，反应液过PTFE滤膜后进行LC-MS/MS分析。

1.4.2 乙草胺土壤样品前处理

取土壤样品10 g，与6 g硅藻土混合均匀，装填至22 mL的萃取罐中。用同样方法装填好2个萃取罐，置于HPSE中（双通道运行，可同时萃取2个样品），萃取溶剂为丙酮∶正己烷（1∶1），系统压力10.34 MPa，萃取温度100℃，加热平衡时间2 min，静态萃取时间6 min，冲洗体积60%，氮气吹扫60 s，循环运行两次。萃取液收集到60 mL收集管中。转移收集液到250 mL旋蒸瓶中，用正己烷-丙酮混合溶剂洗涤收集管3次，每次5 mL，合并所有提取液40℃旋转蒸发至近干，用5 mL正己烷洗涤旋蒸瓶，得到复溶液。将弗罗里硅土固相萃取柱依次用5 mL正己烷-二氯甲烷（正己烷∶二氯甲烷=1∶9）混合溶剂和5 mL正己烷活化，当溶剂液面到达固相萃取柱吸附填料上表面时，立即导入复溶液，用100 mL旋蒸瓶收集淋洗液，并用5 mL正己烷-二氯甲烷混合溶剂洗涤原旋蒸瓶过柱，每次5 mL，淋洗3次，收集淋洗液，40℃旋转蒸发至近干，用5 mL正己烷溶解，50℃氮吹至近干，用1 mL正己烷准确定容，按照本文1.5.2章节进行气相色谱（GC）分析。

1.4.3 茶树新梢样品前处理

称取茶新梢0.25 g于50 mL离心管中，倒入研钵中，添加10 mL纯水进行研磨，超声30 min后5 000 r·min-1离心5 min。取上清液于50 mL离心管中，加入2.5 mL二氯甲烷，涡旋2 min后5 000 r·min-1离心5 min。移取2 mL上清液于5 mL离心管中，加入5 mg GCB和50 mg PVPP，涡旋2 min，以10 000 r·min-1离心10 min。移取1 mL上清液，加入1 mL硼酸盐缓冲液，涡旋2 min，再加入1 mL FMOC-Cl混匀，室温下衍生化反应，放置过夜。将衍生化后的溶液以10 000 r·min-1离心10 min，过0.22 μm亲水性滤膜，待LC-MS/MS检测。

1.5 仪器分析

1.5.1 LC-MS/MS分析

安捷伦液相色谱串联三重四极杆质谱仪（LC-MS/MS）：1260超高效液相色谱仪串联6460三重四极杆质谱（美国安捷伦科技有限公司），色谱柱：Agilent EC-C18（1.8 μm×2.1 mm ×50 mm），柱温：30℃，进样量5 μL，流动相流速为0.3 mL·min-1，A相为0.002 mol·L-1甲酸铵，B相为乙腈。梯度洗脱程序为：0~1.5 min：10%~50% B，1.5~2 min：50%~95% B；2~3 min：95%~95% B；3~3.1 min：95%~10% B；3.1~6 min：10% B。质谱：电喷雾离子源，正离子扫描模式，鞘气温度为350℃，鞘气流速为11.0 L·min-1，雾化气压力为35.0 psi，检测方式为多反应监测，质谱参数见表2。

1.5.2 GC分析

气相色谱7890B（美国安捷伦科技有限公司），色谱柱：HP-5毛细管柱30 m×0.32 mm×0.25 μm，进样口温度：250℃，尾吹气流量：15 mL·min-1，进样方式：不分流，载气：氮气，流速：1.0 mL·min-1，程序升温：初温为100℃，25℃·min-1升至230℃，保持1 min，再以5℃·min-1升至260℃，保持1 min，后以10℃·min-1升至270℃，保持3 min，检测器温度：300℃。

表2 草甘膦、草铵膦和氨甲基膦酸质谱参数

2 结果与分析

2.1 方法验证

2.1.1 LC-MS/MS分析

分别称取0.5 g空白土壤于离心管中，添加0.1 mg·kg-1和1 mg·kg-1草甘膦、草铵膦和氨甲基膦酸混合标准溶液（6次重复），参照1.4和1.5章节中的方法分析，使用内标法定量，0.05 μg·mL-1草甘膦标准溶液和0.05 μg·mL-1草甘膦内标计算校正因子为0.848。方法学评价结果见表3，3种农药标准溶液在0.001~0.5 μg·mL-1呈现良好线性关系，相关系数2超过0.99，回收率为66.4%~90.1%，相对标准偏差（RSD，n=6）为4.00%~19.10%，方法的定量限为0.1 mg·kg-1。

2.1.2 GC分析

乙草胺的加标含量为0.005 mg·kg-1和0.100 mg·kg-1（重复5次），测定加标回收率、重复性和检测限。方法学评价结果见表3，乙草胺标准溶液在0.01~1.0 μg·mL-1呈现良好的线性关系，相关系数R超过0.99，回收率均在102.7%~110.2%之间，RSD（n=5）在0.13%~4.20%，方法的定量限为0.005 mg·kg-1。

2.2 不同除草剂对茶园杂草防效比较

2.2.1 药害观察

各药剂处理区茶树生长正常，未见药害产生。

2.2.2 田间药效

4个施药小区喷施草甘膦、草甘膦+乙草胺、草甘膦+安融乐、草胺磷后，分别于7、14、21 d对野老鹳、续断菊、小飞蓬和小蓟杂草计数，结果见表4，7 d后，各处理组杂草防效均低于70%；第14天，草甘膦对小飞蓬的防效达96.88%，对小蓟的防效达100%；第21天，草甘膦对野老鹳、续断菊、小飞蓬和小蓟杂草的防效超过90%；草甘膦+乙草胺组14 d后对小飞蓬的防效达92.50%（小蓟为100%），第21天对续断菊和小蓟杂草防效在95%以上；草甘膦+助剂组第14天对小飞蓬的防效达100%，第21天对续断菊的防效达96.40%；草铵膦组第14天对野老鹳、续断菊和小飞蓬杂草的防效达95%以上，第21天对这3种杂草的防效均达100%。

各药剂对茶园杂草盖度的影响结果见图2。第7天各处理组的杂草盖度均明显低于处理前，从第7天到第56天，杂草盖度先降低后增加，第21天时，杂草盖度最低，草甘膦、草甘膦+乙草胺混剂、草甘膦+助剂混剂和草铵膦各处理组分别为4.6%，4.3%，5.9%，6.3%。草甘膦+乙草胺处理组第35天和第56天，杂草盖度均低于其他3个处理组，显示乙草胺处理组作为封闭型除草剂，对一年生禾本科及部分阔叶杂草起到较好的防治效果。第56天，4个处理组杂草盖度均高于处理前，说明杂草生长到处理前的状态或者比处理前更加茂盛，结合表4的防治效果，进一步证明4组药剂在处理后的第21天达到最好杂草防治效果，随后受害杂草恢复或者新生杂草萌发；4组药剂中草铵膦对杂草的防治起效快，商品化助剂无显著增效作用。

表3 草甘膦、草铵膦、氨甲基膦酸和乙草胺在土壤中的添加回收率和相对标准偏差

表4 不同药剂对茶园杂草的防效

注：BT：药剂处理前，PMG：草甘膦；PMG+ACE：草甘膦+乙草胺；GLU：草铵膦；PMG+ARL：草甘膦+助剂

2.2.3 农药残留动态

进一步比较了0~58 d后土壤中各除草剂的残留降解动态（图3），结果表明，含草甘膦除草剂的3个试验小区（草甘膦、草甘膦+乙草胺和草甘膦+助剂）在施药2 h后，草甘膦残留分别为1.20、0.57、1.45 mg·kg-1，草甘膦的降解产物氨甲基膦酸残留分别为0.62、0.41 mg·kg-1和1.38 mg·kg-1（草甘膦制剂中并未检测到降解产物氨甲基膦酸），结果表明草甘膦在土壤中降解较快，可能是茶园土壤中微生物和茶园土壤特性促进了草甘膦降解[12-14]。3个试验小区土壤中草甘膦残留浓度随着时间的延长总体呈现降低、增加、降低的波动趋势，可能是草甘膦被土壤中的有机质和矿物质等土壤组分不断吸附解析，或因微生物及光照等作用发生降解[15]。施药后第58天，3个小区土壤中草甘膦消解率分别为95%、53%和66%（图3-a、图3-c1、图3-d）。草铵膦、乙草胺在土壤中的残留动态与草甘膦显著不同，草铵膦处理后58 d的土壤中草铵膦的消解率为97%，第7天的土壤残留浓度突然降低可能是取样不均匀所致（图3-b）；乙草胺残留逐渐降低，58 d后消解率为99%（图3-c2）。课题组前期对水培茶苗草甘膦的吸收、转运代谢规律研究发现，草甘膦可经茶苗根部吸收并转运到叶部，第5天叶部的累积量达到最高值，随后逐渐降低。此次，我们在药剂喷施后的第5天，采摘草甘膦处理小区和对照小区内的茶树新梢，检测草甘膦的残留量，发现处理组与对照组茶树新梢中草甘膦的残留量均低于定量限，说明本试验过程中草甘膦的喷施未造成茶叶中草甘膦残留，因此草甘膦单次施药对茶鲜叶中草甘膦残留影响不大。

3 讨论

试验结果表明，与草甘膦相比，草铵膦农药起效快，施药第7天覆盖度为9.15%，施药14 d对野老鹳、续断菊、小飞蓬等杂草的防治效果在95%以上，而且草铵膦在土壤中的残留降解较快，30 d的消解率达到94%，残留水平较低（第58天残留量为0.01 mg·kg-1），因此，草铵膦或许可以作为草甘膦替代性除草剂用于茶园杂草防治。另外，乙草胺对禾本科杂草的出苗率有一定的抑制作用，且乙草胺在土壤中降解相对较快（21 d后的消解率为97%），因此乙草胺可作为禾本科杂草和其他杂草的苗前处理剂。然而，有关这类除草剂的田间药效评价需进一步利用比较生物量的统计方法加以验证，且除草剂对茶园土壤生态环境及茶叶质量安全造成的潜在影响有待于进一步评估。

注：a：草甘膦；b：草铵膦；c1和c2：草甘膦+乙草胺；d：草甘膦+助剂，PMG：草甘膦；AMPA：氨甲基膦酸；GLU：草铵膦；ACE：乙草胺

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Weeds Control Effect and Residues of Several Herbicides in Tea Gardens

GAO Wanjun1, ZHANG Yongzhi1, TONG Mengmeng1, MA Huiqin2, QIAN Shanshan3,WANG Tianyu3, LI Yeyun1, WU Huiping2*, HOU Ruyan1*

1. State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China;2. School of Plant Protection, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China;3. Public Inspection Institute(Anhui) Co., Ltd, Hefei 230051, China

The weeds control effect of several herbicides (glyphosate, glufosinate and combination of glyphosate-acetochlor and glyphosate-auxiliaries) and the herbicides residues in the soil of treated plots in the tea gardens were compared. The results show that the glufosinate had a faster control effect on the weeds. The coverage of weeds decreased to 9.15% on the 7thtreatment day. The control efficiency of glufosinate to theL.,(L.) Hill.,(L.) Cronqreached more than 95% on the 14thday. Glufosinate showed a faster degradation (the dissipation ratio was 94% on the 30thday) in the soil than the glyphosate (the residue concentration was 0.01 mg·kg-1on the 58thtreatment day). Therefore, glufosinate might be an alternative herbicide for weed control in tea gardens. Acetochlor, as a closed herbicide, had the potential of inhibiting the emergence of gramineous weeds and faster dissipation rate in the soil (the dissipation ratio was 97% on the 21thday), and therefore, it was recommended to control gramineous or the other weeds.

tea garden, herbicide, efficacy, pesticide residue

S571.1；S482

A

1000-369X(2019)05-587-08

2018-12-20

2019-02-19

国家重点研发计划项目（2016YFD0200900）、国家自然科学基金（31772076和31270728）

高万君，女，硕士，主要从事茶叶化学与安全方面的研究。*通信作者：whp@ahau.edu.cn；hry@ahau.edu.cn