HPLC测定罗布麻茶黄酮主要组成成分及其体外抗氧化特性研究

张 静 任小利 - 李希希 - 易 沙 李 冲 赵 欣 n

(1. 重庆化工职业学院环境与质量检测学院，重庆 401228；2. 重庆第二师范学院重庆市功能性食品协同创新中心，重庆 400067)

罗布麻属野生草本多年半灌木，多分布于中国西北地区[1]。罗布麻叶除被作为中药使用外，也被加工成茶类饮品使用。罗布麻叶含有黄酮类、有机酸类、苯丙素类及多种氨基酸和矿物质，能起到降血压、降胆固醇、抗衰老、提高免疫力[2-5]及抗抑郁[6-7]等功效。植物黄酮是一类具有较强抗氧化能力的物质，能有效清除自由基[4-5]。黄酮类为罗布麻叶中最主要的功效成分[8]，罗布麻叶所含黄酮类成分主要有芦丁、槲皮素、异槲皮苷、金丝桃苷、木樨草素等[8-10]。罗布麻部分生理活性作用已得到初步验证，主要是基于罗布麻的粗提物，而罗布麻活性成分与其作用间的关系尚未清楚，尤其是对罗布麻黄酮成分的分析及产生抗氧化活性作用的机制尚未见报道。

罗布麻茶黄酮成分的提取方法主要有超声提取法[11]、加热回流法[12]、聚酰胺层析法[13]、大孔树脂法[14]。芦丁和异槲皮苷均为多羟基黄酮类化合物，结构中存在大量的羟基，极性强，易溶于极性溶剂。试验拟采用减压加热回流结合大孔吸附法提取新疆罗布麻茶中的黄酮类物质，通过高效液相色谱分析法测定罗布麻茶黄酮中芦丁和异槲皮苷含量，对罗布麻茶黄酮的体外抗氧化效果进行检测，并结合黄酮成分的分析结果对罗布麻茶黄酮的作用机制进行阐述，为罗布麻茶进一步功能性开发研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

罗布麻茶：野生罗布麻茶，新疆沙雅县；

芦丁、异槲皮苷对照品：分析纯，北京索莱宝科技有限公司；

1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH)：分析纯，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；

2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)：分析纯，南京都莱生物技术有限公司；

VC(抗坏血酸)：分析纯，北京索莱宝科技有限公司；

甲醇、乙腈：色谱纯，重庆川东化工有限公司；

乙酸、硫酸亚铁、过硫酸钾、30%过氧化氢、水杨酸、无水乙醇：分析纯，成都市科龙化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱系统：Ultimate 3000型，美国Thermo Scientific公司；

多功能酶标仪：Varioskan LUX型，美国Thermo Scientific公司；

超声波清洗器：KQ-250ES型，昆山市超声仪器有限公司；

电子分析天平：XB4200C型，瑞士Precisa公司；

超纯水制造系统：UPH-Ⅱ-20T型，四川优普超纯科技有限公司；

旋转蒸发仪：RE-2000B，上海亚荣生化仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 罗布麻茶黄酮提取 FL-3大孔树脂先用无水乙醇浸泡24 h，再用3%盐酸浸泡2 h后用蒸馏水冲洗至中性，用蒸馏水浸泡待用。将50 g干罗布麻茶粉碎过40目筛后在茶粉中加入70%乙醇(料液质量比20∶1)，然后于60 ℃水浴中浸提3 h。提取液通过大孔树脂后黄酮物质被吸附，再用乙醇(50%，60%，70%，80%，质量分数)洗脱树脂上的黄酮物质，洗脱至树脂无色即黄酮物质完全被洗出，然后用旋转蒸发仪旋蒸黄酮洗出液，最后得到蒸干的黄酮提取物。

1.3.2 标品溶液配制 精密称取适量芦丁、异槲皮苷标品，加入甲醇溶解，分别配制成浓度为1.812 5，1.033 3 mg/mL 的芦丁、异槲皮苷标品溶液。分别精密吸取0.2 mL芦丁、异槲皮苷标品液，再用甲醇配制成浓度分别为0.181 25，0.103 33 mg/mL 的混标溶液。

1.3.3 样品溶液 精密称取0.5 g罗布麻多酚提取物粉末于10 mL容量瓶中，用甲醇进行定容，超声处理后用0.45 μm 滤膜过滤，待测。

1.3.4 色谱条件 色谱柱AgilentzorbaxSB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)，按表1进行梯度洗脱，流动相A为乙腈，流动相B为0.5%乙酸溶液，流速0.6 mL/min，柱温35 ℃，检测波长359 nm，进样量10 μL[15]。

表1 HPLC流动相梯度洗脱程序

1.3.5 线性关系 将芦丁、异槲皮苷标品溶液稀释后分别进样1，2，4，8，12，16，20 μL，按1.3.4色谱条件进行分析。以标品进样质量为横坐标X，以相应峰面积为纵坐标Y，得两种标品的线性方程。

1.3.6 精密度、重现性和稳定性试验

(1) 精密度试验：取上述混标溶液重复进样5次，每次10 μL，按上述1.3.4色谱条件对峰面积进行测定。

(2) 重现性试验：精密称取1.3.1方法制备好的样品5份，按1.3.3方法制备待测样品溶液，在1.3.4色谱条件下进行测定。

(3) 稳定性试验：取同一样品溶液，分别在0，2，4，6，8，10，12，24 h按1.3.4色谱条件对芦丁、异槲皮苷的峰面积进行测定。

1.3.7 回收率试验 精密称取已知含量的样品3份，按1.3.3方法制备样品溶液，分别配制成1.3.2中芦丁、异槲皮苷标准品浓度的80%，100%，120%，在已知的色谱条件下进行测定，每份样品测定3次，计算回收率、平均回收率及RSD值。

1.3.8 样品含量测定 称取同一样品粉末3份(每份接近0.1 g，平均0.097 3 g)，按1.3.3方法制备3份样品溶液，用1.3.4色谱条件对样品中芦丁、异槲皮苷的峰面积进行测定，并计算样品中二者的含量及平均含量。

1.3.9 抗氧化能力测定 准确称取1.3.1得到的样品粉末和VC，配置成1.0 mg/mL的样品和VC溶液，依次加水稀释成不同浓度的样品和VC(0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.8 mg/mL)溶液，备用。

(1) DPPH自由基清除试验：参照Aneta等[16-17]的方法，略有改进。取3个离心管(标记为A1，A2，A3)分别加入不同浓度的样品和试剂。其中A1离心管中加入DPPH溶液2.9 mL、样液100 μL；A2离心管中加入无水乙醇2.9 mL、样液100 μL；A3离心管中加入DPPH溶液2.9 mL、80%甲醇溶液100 μL。均匀混合后，于暗处反应30 min，517 nm下测定吸光度，计算DPPH清除率。以VC为阳性对照。

(2) ABTS自由基清除试验：参照Ye等[18-19]的方法，略有改进。取3个离心管(标记为A1，A0，A空)分别加入不同浓度的样品和试剂。其中A1离心管加入ABTS溶液2.0 mL、样液80 μL；A0离心管加入超纯水2.0 mL、样液80 μL；A空离心管加入ABTS溶液2.0 mL、无水乙醇80 μL。均匀混合后，于暗处反应6 min，734 nm下测定吸光度，计算ABTS自由基清除率。以VC为阳性对照。

(3) 羟基自由基清除试验：参照贾荣等[20]方法，略有改进。取3个离心管(标记为A0，Ai，Aj)分别加入不同浓度的样品和试剂。其中A0离心管加入80%甲醇300 μL、FeSO4溶液1.0 mL、水杨酸乙醇溶液1.0 mL 和H2O21.0 mL；Ai离心管加入样液300 μL、FeSO4溶液1.0 mL、水杨酸乙醇溶液1.0 mL 和H2O21.0 mL；Aj离心管加入样液300 μL、FeSO4溶液1.0 mL、水杨酸乙醇溶液1.0 mL 和80%甲醇溶液1.0 mL 。均匀混合后，于37 ℃ 水浴锅中反应30 min，510 nm下测定吸光度，计算羟基自由基清除率。以VC为阳性对照。

1.4 数据处理

对试验进行3次平行测定，计算观察指标的平均值。采用Excel软件对试验数据进行处理及分析。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 流动相的选择 试验比较了甲醇—水、乙腈—水流动相对出峰时间和分离效果等的影响。通过比较基线分离和峰形对称的要求发现，选择乙腈—水作为流动相进行梯度洗脱效果最佳，且芦丁、异槲皮苷分离效果较好。由于加入酸可减少拖峰现象[18]，因此在水相中加入了0.5%磷酸，最终确定的流动相为乙腈—0.5%磷酸水溶液。

2.1.2 检测波长的选择 在254，280，328，359 nm进样检测后发现，芦丁、异槲皮苷在359 nm时响应最好，色谱峰面积较大且分离效果好。故选择359 nm为最佳检测波长，此波长处芦丁、异槲皮苷均有较强吸收峰(图1)。

1. 芦丁 2. 异槲皮苷

2.1.3 线性关系分析 进一步的试验显示芦丁、异槲皮苷的线性方程分别为Y=26.026X+10.496(R2=0.999 55)，Y=45.57X+4.580 7(R2=0.999 65)，且分别在0.453 1～9.062 5，0.258 3 ～5.166 5 μg的范围内呈现良好的线性关系。

2.1.4 精密度、重现性、稳定性试验 在精密度验证中芦丁和异槲皮苷的峰面积RSD值分别为0.11%和0.10%(n=5)，表明本方法的精密度良好。在重现性验证中芦丁和异槲皮苷含量的RSD值分别为1.57%和1.09%(n=5)，表明本方法重现性良好。在稳定性验证中芦丁和异槲皮苷的RSD值分别为1.16%和0.42%，表明芦丁和异槲皮苷在样品溶液中至少24 h内保持稳定。

2.1.5 回收率 由表2可知，芦丁、异槲皮苷的平均回收率分别为99.91%，100.05%(n=9)，表明高效液相法用于罗布麻茶黄酮的质量控制具有良好的准确性。

2.1.6 样品含量测定 由表3可知，罗布麻茶黄酮中含有一定量的芦丁和异槲皮苷，占黄酮总量的50%以上，且异槲皮苷含量高且稳定，与文献[15]报道结果基本一致。

2.2 样品提取方法的优化

由表4可知，当乙醇浓度<70%时，随着乙醇浓度的增加，芦丁、异槲皮苷提取量均明显增加；但当乙醇浓度>70%时，芦丁、异槲皮苷提取量均减小。故确定以70%乙醇为提取溶剂。

表2 回收率试验结果

表3 罗布麻茶黄酮中芦丁、异槲皮苷含量

表4乙醇浓度对罗布麻茶黄酮中芦丁、异槲皮苷提取量的影响

Table 4 Effect of ethanol concentration on the extraction of rutin and isoquercetin inApocynumvenetumtea

乙醇浓度/%芦丁含量/mg异槲皮苷含量/mg500.050 3±0.000 50.638 8±0.040 8600.054 9±0.000 50.658 1±0.041 2700.059 6±0.000 60.673 9±0.039 7800.056 8±0.000 40.663 7±0.039 1

2.3 罗布麻茶体外抗氧化评价

2.3.1 清除DPPH自由基的能力 由图2可知，在一定浓度范围内罗布麻茶黄酮样品和VC样品对DPPH均有一定的清除作用。随着罗布麻茶黄酮样品浓度的增加，对DPPH自由基清除作用不断增强，当其浓度为0.3 mg/mL时清除能力最大，清除率达73.1%，此后随着浓度增加清除率趋于平稳。罗布麻茶黄酮清除能力明显高于同浓度的VC对DPPH的清除能力，说明罗布麻茶纯化后的黄酮样品有较强的清除DPPH自由基的能力。

图2 罗布麻茶黄酮的DPPH清除率

2.3.2 清除ABTS自由基的能力 由图3可知，罗布麻茶黄酮对ABTS自由基有一定的清除能力，随着样品浓度的增加，清除能力逐渐增强。在样品浓度为1 mg/mL时清除率高达60.2%，此时VC对ABTS的清除率仅为20.8%，故罗布麻茶清除ABTS自由基的能力较强。

图3 罗布麻茶黄酮的ABTS清除率

2.3.3 清除羟基自由基的能力 由图4可知，当罗布麻茶黄酮样品和VC浓度在0.2～0.4 mg/mL时，清除能力相当，清除率在6%～10%；随着样品浓度的增加，罗布麻茶黄酮对羟基自由基清除率明显增强，当浓度为1.0 mg/mL 时，清除率达25.7%，清除能力远大于同浓度VC，可能与黄酮类化合物分子结构中所含羟基数有关。

3 结论

试验利用高效液相色谱法测定了罗布麻茶黄酮中芦丁、异槲皮苷含量，并通过体外试验发现罗布麻茶黄酮对DPPH自由基、ABTS自由基和羟基自由基均具有良好的清除作用。本研究中提取的罗布麻茶黄酮中芦丁、异槲皮苷含量占黄酮总量的50%以上，通过包括芦丁、异槲皮苷在内的黄酮起到了较好的体外清除自由基能力。但本研究中只针对含量最高的芦丁和异槲皮苷含量进行了具体分析，研究[21-22]显示，不同的罗布麻黄酮还含有金丝桃苷、槲皮苷、白麻苷、山萘酚-3-O-β-D-芸香糖苷、扁蓄苷和乙酰化金丝桃苷等物质，因此罗布麻茶黄酮成分分析及各物质间的协同作用有待进一步研究。

图4 罗布麻茶黄酮的羟基自由基清除率