白芥子散及其拆方对过敏性哮喘大鼠神经肽的影响

王艳宏， 樊 建， 赵娟萍， 李洪晶， 关 枫， 冯宇飞， 杨志欣

（黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨150040）

哮喘是一种以肥大细胞、嗜酸性粒细胞、T 淋巴细胞参与的慢性气道炎症和可变性呼气流量限制为特征的异质性疾病［1］，给人们工作、生活、家庭经济等各方面带来沉重负担。根据2013 年哮喘认知和管理（AIM） 调查显示，中国哮喘急性发作比例居亚太地区首位（67%）［2］，儿童患病率高于成年人，并呈逐年增长的趋势［3］。

目前，中药经皮给药治疗哮喘的方药大多源于清朝张璐所著《张氏医通》 中的白芥子散，其制法为“方用白芥子一两，延胡索一两，甘遂和细辛各半两，共为细末，姜汁调涂肺俞、膏肓与百劳等穴”。2009 年中国针灸学会制定的穴位贴敷临床应用指导意见草案指出： “穴位贴敷以白芥子、延胡索、甘遂、细辛和生姜为基本处方，现代医家可结合既往临床经验、地域特点等在此基础上进行加减”［4］。该方是中药穴位贴敷治疗哮喘最基础、最具代表性的方剂之一，临床上已得到广泛认可，但目前尚无药物对腧穴作用方面机制的研究。因此，本实验选择P 物质（SP）、 血 管 活 性 肠 肽 （VIP）、 降 钙 素 基 因 相 关 肽（CGRP） 等与腧穴作用相关的神经肽形态和数量变化为指标，探讨白芥子散及其拆方穴位贴敷对大鼠施药腧穴皮肤的作用，以及与肺组织作用的相关性，以期为开展相关研究提供全新视角。

1 材料

1.1 试药 白芥子、延胡索、甘遂、细辛均购自黑龙江中医药大学附属第一医院，生姜购于云南汇轩生物科技有限公司，经黑龙江中医药大学药学院孙慧峰教授鉴定为正品，均符合2015 年版《中国药典》 一部的相关要求。妥洛特罗贴剂购于日东制药有限公司。IgE 酶联免疫吸附试剂盒（A04237）， 兔 抗 大 鼠 SP、 VIP、 CGRP 多 克 隆 抗 体（BA3678、PB1017、PB0967）， 多聚体抗兔免疫球蛋白（IgG） -辣根过氧化物酶（HRP）、DAB 显色剂均购于武汉博士德生物工程有限公司。卵清蛋白（OVA） 购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器 超薄切片机（RM2245 型，德国Leica 公司）；低温高速离心机（3-18R 型，美国Tomos 公司）；超声雾化仪（402B 型，上海鱼跃医疗设备有限公司）；光学显微镜（CX441 型，日本Olympus 公司）；病理图像分析系统（美国moticam3000 型， 美 国Moticam 公 司）； 恒 温 水 浴 锅（HH-S8 型， 金 坛 华 龙 实 验 仪 器 厂）； 多 功 能 酶 标 仪（DNM-9602 型，北京普朗新技术有限公司）。

1.3 动物 SD 大鼠，雄性，体质量（160±10）g，购于辽宁长生生物技术有限公司，生产许可证号SCXK （辽）2015-0001，合格证号211002300016031，在SPF 级屏障动物房［室温（20±2）℃；相对湿度55%～70%］ 中饲养1 周。

2 方法

2.1 白芥子散及其拆方提取物制备 按照处方配比（白芥子∶延胡索∶细辛∶甘遂∶生姜＝2 ∶2 ∶1 ∶1 ∶6） 并参考文献［5-8］ （稍作改动） 进行制备。各称取处方量白芥子、延胡索、甘遂，粉碎成粗粉后分别加入10 倍量80%乙醇浸泡12 h，75 ℃回流提取3 次，每次2 h，过滤后合并药液，减压浓缩至1.3 g／mL，即得白芥子、延胡索、甘遂提取物。根据2015 年版《中国药典》 一部附录XD“挥发油测定法” 中的甲法，取处方量细辛置于圆底烧瓶中，加12倍量蒸馏水与玻璃珠数粒，浸泡2 h 后加热回流提取6 h，即得细辛挥发油。根据2015 年版《中国药典》 “姜汁” 制法，生姜洗净、晾干表面水分后切成碎块，榨汁，过120目筛，姜渣加入适量水，搅拌均匀后2 层纱布滤过，使姜汁体积与质量的比例为1 ∶1，再取姜汁适量，加1.5 倍量石油醚萃取3 次，每次2 h，分液后合并药液，减压蒸馏，即得生姜挥发油。称取处方量白芥子、 延胡索、 甘遂（2 ∶2 ∶1），粉碎成粗粉后加入10 倍量80%乙醇浸泡12 h，75 ℃回流提取3 次，每次2 h，合并药液，减压浓缩至1.3 g／mL。浓缩液及细辛、生姜挥发油在45 ℃水浴中以原处方比例均匀混合，即得白芥子散提取物。

2.2 分组 80 只大鼠随机分为正常组、模型组、阳性药物组、白芥子散穴位组、白芥子散非穴位组、白芥子穴位组、延胡索穴位组、甘遂穴位组、细辛穴位组和生姜穴位组，每组8 只。

2.3 模型建立［9］第1 天，大鼠腹腔注射新鲜配制的含10%卵清蛋白生理盐水溶液（5 mL／kg） 致敏，第8 天同法进行第2 次致敏，第15 天以新鲜配制的含1%卵清蛋白生理盐水溶液 （中速雾化量） 进行雾化激发哮喘，每次7 min，1 次／d，连续雾化14 d。同时，观察大鼠是否出现挠鼻、打喷嚏、腹式呼吸、呼吸急促、点头呼吸，甚至腹部痉挛等呼吸困难症状。正常组大鼠以生理盐水代替，其余操作同模型组。

2.4 药物贴敷穴位选取 大鼠施药穴位以中国针灸学会实验针灸学分会制定的《动物针灸穴位图谱》［10］为依据，与哮喘相关的穴位选双侧肺俞穴，非穴位为腧穴位旁开1 cm处。肺俞穴为第3 胸椎下两旁肋间，左右侧各1 穴。

2.5 给药 “2.1” 项下各提取物和挥发油均与适量2%羧甲基纤维素钠 （CMC-Na） 混合均匀后给药，面积约1.5 cm×1.5 cm，厚约0.2 cm，阳性药物组大鼠给予妥洛特罗贴剂（面积约1.5 cm×1.5 cm），正常组、模型组大鼠给予2%CMC-Na，连续10 d，1 次／d，每次6 h。

2.6 样本采集 末次给药后24 h 内取样。①称定各组大鼠体质量并记录，腹腔注射7%水合氯醛麻醉；②打开腹腔，用不加抗凝剂的一次性真空采血管腹主动脉取血5 mL，血样静置45 min 后4 ℃、3 000 r／min 离心15 min，吸取上清液，置于-80 ℃冰箱中保存；③打开胸腔，暴露并结扎总支气管及分支气管，用含有生理盐水的输液器灌洗左肺，并抽取支气管肺泡灌洗液（BALF），重复3 次，合并灌洗液，置于4 ℃冰箱中保存；④迅速取出右肺组织，生理盐水洗净，置于4%甲醛中固定；⑤取施药局部组织皮肤，生理盐水洗净，置于4%甲醛溶液中固定。

2.7 指标检测

2.7.1 哮喘潜伏期一般状态 记录各组大鼠活动情况、毛发、舌质口唇、呼吸等一般状态变化。

2.7.2 大鼠BALF 中肥大细胞 BALF 4 ℃、2 500 r／min离心10 min 后，吸弃上清液，下层沉淀物加入2%Hank’s溶液，制成细胞悬浮液，吹于玻璃片上，中性红染色1 min后加盖玻片，置于37 ℃恒温箱中温育3 min，高倍镜下计数6 个以上视野的平均肥大细胞数目，并观察细胞形态及其脱颗粒情况。

2.7.3 血清IgE 水平 取低温冻存的血清，酶联免疫吸附（ELISA） 法检测IgE 水平，所有操作步骤均严格按照说明书进行。

2.7.4 施药局部皮肤及肺组织SP、VIP、CGRP 表达 取4%甲醛固定的大鼠施药局部皮肤和肺组织，石蜡包埋切片后采用免疫组化PV 二步法检测SP、VIP、CGRP 表达，所有操作步骤均严格按照说明书进行：①切片常规脱蜡至水；②3% H2O2中温育10 min，PBS 缓冲液洗涤3 次，每次2 min；③切片放入枸椽酸盐缓冲液（pH＝6），微波炉中修复2 次，每次5 min，每次间隔10 min；④滴加一抗，37 ℃温育60 min，PBS 缓冲液洗涤3 次，每次2 min；⑤滴加二抗，37 ℃温育20 min，PBS 缓冲液洗涤3 次，每次2 min；⑥DAB 显色5 ～10 min；⑦蒸馏水充分洗涤后苏木素复染1 min；⑧常规脱水透明，中性树胶封片，显微镜下观察。然后，Motic3000 显微摄影系统于400 倍下摄片，Image-pro plus 6.0 病理图像分析系统对阳性表达进行定量分析，以积分光密度（IOD） 代表基因和蛋白相对表达量（IOD ＝阳性面积×平均光密度），每组随机分析8 个高倍镜视野，取其平均值代表该图片相对表达量。

2.8 统计学分析 通过SPSS 20.0 Statistics 软件进行处理，数据以（）表示，组间比较采用独立样本t 检验或单因素方差分析。以P＜0.05 或P＜0.01，表示显著具有统计学意义。

3 结果

3.1 哮喘潜伏期大鼠一般状态 正常组大鼠活动状态正常，舌质口唇俱佳，毛色光洁，呼吸平稳；模型组大鼠行动迟滞，舌质口唇发紫，毛发枯黄，出现打喷嚏、呼吸急促，并伴有喘鸣音等症状；阳性药物组、白芥子散穴位组大鼠精神状态显著改善，反应灵敏，未出现呼吸急促、呼吸困难等症状；白芥子散非穴位组大鼠反应迟钝，毛发枯黄，伴有腹式呼吸等症状；白芥子穴位组、细辛穴位组、生姜穴位组大鼠毛色略光洁，呼吸较平稳；甘遂穴位组大鼠呼吸稍急促，轻微紫绀，呼吸困难症状减轻；延胡索穴位组大鼠毛发枯黄，出现挠鼻、呼吸急促，并伴有喘鸣音等症状。

3.2 白芥子散及其拆方对肥大细胞的影响 表1 显示，与正常组比较，模型组肥大细胞数显著增多（P＜0.01），约有半数发生脱颗粒现象；与模型组比较，白芥子散及其各拆方穴位组上述现象显著改善（P＜0.05）；与白芥子散穴位组比较，白芥子散非穴位组、延胡索穴位组、甘遂穴位组肥大细胞数显著增多（P＜0.05，P＜0.01），而且脱颗粒现象更严重。

表1 白芥子散及其拆方对肥大细胞的影响n＝8）

表1 白芥子散及其拆方对肥大细胞的影响n＝8）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01；与白芥子散穴位组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01

组别 肥大细胞数／个 肥大细胞脱颗粒率／%正常组 15.17±2.32 23.08±2.81模型组 37.67±2.72** 43.72±3.21**阳性药物组 19.20±2.40＃＃ 25.27±2.20＃＃白芥子散穴位组 16.67±2.73＃＃ 25.78±2.20＃＃白芥子散非穴位组 35.67±2.95ΔΔ 40.51±3.35ΔΔ白芥子穴位组 18.83±2.36＃＃ 26.90±2.04＃＃延胡索穴位组 29.67±2.73＃ΔΔ 31.81±2.88＃＃Δ甘遂穴位组 23.50±2.23＃＃Δ 29.42±2.12＃＃细辛穴位组 21.07±2.37＃＃ 30.20±2.53＃＃生姜穴位组 20.45±2.45＃＃ 28.87±2.25＃＃

图1 显示，正常组大鼠肥大细胞体积大，大多数胞质颗粒呈圆形或椭圆形，细胞膜完整，极少数发生脱颗粒现象；模型组大鼠肥大细胞数目密集，体积小，形状不规则，大多数细胞膜破裂，细胞边界模糊，少数有双核现象，脱颗粒现象明显增多；白芥子散穴位组、阳性药物组大鼠肥大细胞形态与正常组相似；白芥子散非穴位组大鼠肥大细胞形状不规则，脱颗粒现象较为严重，与模型组相似。

3.3 白芥子散及其拆方对IgE 水平的影响 表2 显示，与正常组比较，模型组IgE 水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，除延胡索穴位组外其余各穴位组其水平显著降低（P＜0.01）；与白芥子散穴位组比较，白芥子散非穴位组、延胡索穴位组其水平显著升高（P＜0.01）。

表2 白芥子散及其拆方对IgE 水平的影响n＝8）

表2 白芥子散及其拆方对IgE 水平的影响n＝8）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01；与白芥子散穴位组比较，△△P＜0.01

组别 IgE／（ng·mL-1）正常组 9.64±0.22模型组 15.11±1.75**阳性药物组 11.14±1.27＃＃白芥子散穴位组 10.99±1.24＃＃白芥子散非穴位组 14.59±0.62△△白芥子穴位组 11.38±1.10＃＃延胡索穴位组 14.42±1.58△△甘遂穴位组 11.85±1.15＃＃细辛穴位组 11.53±1.28＃＃生姜穴位组 11.69±1.35＃＃

图1 各组大鼠肥大细胞形态（×400）

3.4 白芥子散及其拆方对SP、 VIP、 CGRP 表达的影响 图2、表3 显示，与正常组比较，模型组2 个部位中SP 表达显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组施药局部皮肤中其表达显著降低（P＜0.01），除白芥子散非穴位组、延胡索穴位组、甘遂穴位组外各给药组肺组织中亦然（P＜0.05，P＜0.01）；与白芥子散穴位组比较，白芥子散非穴位组、延胡索穴位组2 个部位中其表达显著升高（P＜0.05，P＜0.01）。

图2 各组大鼠SP 水平（×400）

表3 白芥子散及其拆方对SP、VIP、CGRP 表达的影响n＝8）

表3 白芥子散及其拆方对SP、VIP、CGRP 表达的影响n＝8）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；与白芥子散穴位组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别 施药局部S皮P／ 肤（ IOD ·0.25 cm-2肺）组织 施药局部V皮I P肤／（ I OD·0.25 cm-2肺）组织 施药局部皮肤CG RP ／（IOD·0.25 cm-肺2） 组织正常组 15 179.40±1 517.86 15 850.62±1 188.44 22 571.40±2 086.82 23 515.82±2 660.05 17 454.16±2 019.19 18 093.18±2 436.25模型组 25 441.00±2 579.99** 24 110.15±2 472.45** 14 861.79±1 821.02** 18 077.51±2 443.04** 26 251.52±1 946.11** 26 022.54±2 309.73**阳性药物组 16 965.54±1 562.56＃＃ 17 483.72±1 960.79＃＃ 22 217.18±1 604.51＃＃ 23 076.07±2 281.45＃ 19 353.66±1 690.2＃＃ 18 461.14±2 089.82＃＃白芥子散穴位组 15 900.77±1 733.70＃＃ 16 922.79±1 790.90＃＃ 22 796.03±1 886.41＃＃ 23 114.95±2 515.74＃ 16 739.73±1 065.81＃＃ 18 117.95±1 224.26＃＃白芥子散非穴位组 20 301.86±1 773.20＃＃△23 154.15±2 090.33△△18 175.11±1 980.28＃△△18 819.16±2 412.91△ 21 382.70±2 253.33△△ 23 448.13±2 564.18＃＃△△白芥子穴位组 17 557.12±1 826.29＃＃ 19 403.46±1 590.33＃ 21 038.92±2 001.69＃＃ 22 376.49±2 399.19 19 481.93±1 811.78＃＃ 18 969.51±2 288.98＃＃延胡索穴位组 19 727.72±1 965.57＃＃△22 990.50±2 004.40△ 19 305.15±1 328.11＃＃ 18 933.51±1 743.75△ 20 413.21±1 501.43＃△ 21 344.75±1 732.53＃＃△甘遂穴位组 17 319.86±1 492.24＃＃ 19 876.14±1 741.59 21 869.13±1 875.67＃＃ 21 936.84±2 461.04 18 264.26±2 133.59＃＃ 19 183.02±2 349.94＃＃细辛穴位组 17 298.66±2 413.85＃＃ 20 201.33±2 361.35＃ 20 292.28±1 000.45＃＃ 22 338.49±1 580.88 18 885.53±1 990.40＃＃ 20 550.13±2 476.03＃＃生姜穴位组 17 201.66±1 879.30＃＃ 19 687.14±2 401.35＃ 21 032.15±1 210.45＃＃ 22 157.52±1 410.65 18 535.53±1 990.40＃＃ 19 010.02±2 349.94＃＃

图3、表3 显示，与正常组比较，模型组2 个部位中VIP 表达显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，白芥子散及其各拆方穴位组施药局部皮肤中其表达显著升高（P＜0.01），白芥子散穴位组肺组织中其表达亦然（P＜0.05）；与白芥子散穴位组比较，白芥子散非穴位组2 个部位中其表达显著降低（P＜0.05，P＜0.01），延胡索穴位组肺组织中其表达亦然（P＜0.05）。

图3 各组大鼠VIP 水平（×400）

图4、表3 显示，与正常组比较，模型组2 个部位中CGRP 表达显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组肺组织中其表达显著降低（P＜0.01），除白芥子散非穴位组外各给药组施药局部皮肤中其表达亦然（P＜0.05，P＜0.01）；与白芥子散穴位组比较，白芥子散非穴位组、延胡索穴位组2 个部位中其表达显著升高（P＜0.05，P＜0.01）。

图4 各组大鼠CGRP 水平（×400）

4 讨论

过敏性哮喘的病理生理基础是过敏性炎症，主要表现为胸闷、胸痛、咳嗽、喘息、呼吸困难等症状，其发病机制十分复杂，迄今尚未完全阐明，可能由多种机制共同参与，如免疫-炎症机制和神经-内分泌机制等（图5）［11-13］。其中，免疫-炎症机制认为哮喘在本质上是一种变态反应性气道炎症，而肥大细胞是其主要效应细胞［14］，与非哮喘患者相比，哮喘患者BALF 中肥大细胞数目明显增多，其分泌的组胺、类胰蛋白酶水平明显升高［15］，此外肥大细胞还可通过脱颗粒反应释放多种炎症介质，如白三烯、转化生长因子等，进而引起气道损伤和肺部病理加重［16］。

图5 过敏性哮喘发病机制

IgE 能激活嗜酸性粒细胞、肥大细胞、参与体内抗原呈递的细胞，故IgE 既是引起过敏性哮喘发作的关键，又是免疫病理改变的重要指标［17］。当机体受到过敏原刺激时，IgE 交联导致肥大细胞和嗜酸性粒细胞脱颗粒并释放炎症介质（如白三烯和组胺），从而引发哮喘炎症反应［18］。

气道上皮表面下方的感觉神经纤维在感受到环境变化时，可刺激神经肽释放，引起支气管管腔收缩及黏液过度分泌，进而引发哮喘，其中神经肽SP、VIP、CGRP 在哮喘气道慢性炎症和气道高反应性形成过程中起到重要作用。哮喘患者气道上皮受损时，SP、CGRP 释放增加，引起患者气道平滑肌收缩、腺体分泌增加、微血管渗漏、炎症浸润等病理生理改变［19］。郑秀丽等［20］发现，过敏性哮喘大鼠肺组织中VIP 水平明显降低，而SP、CGRP 水平明显升高；相关研究报道［21-22］，SP、CGRP 水平升高会刺激IgE 分泌增多，而VIP 能拮抗SP、CGRP，它不仅是目前发现的最强内源性支气管扩张剂，对支气管平滑肌具有舒张作用，而且对炎症介质的释放和抗损伤具有较强的抑制作用，能降低IgE 水平，参与调节免疫变态反应。

《黄帝内经》 首次提出“肺主皮毛”，认为皮肤与肺之间存在特殊的关系，指出“皮毛疾病可以治肺而收功，肺疾病亦可以治疗皮毛而奏效”［23］，肺与皮毛相生相合，两者通过经脉相互联系，而穴位则是经脉在皮肤的特定敏感点，故临床上常采用穴位贴敷疗法治疗肺系疾病。清代外治大师吴师机曾强调， “膏药贴法与针灸通”；现代相关研究亦表明其相关性［24-26］，在正常穴位存在少量组胺（HA）和5-羟色胺（HT） 标记的完整形态的肥大细胞，但在针刺后其细胞聚集数与未针刺的穴位相比显著增多；针刺穴位后SP、CGRP 高表达的神经纤维在其局部分布，而且肥大细胞聚集在SP 或CGRP 阳性神经纤维周围。

本实验结合皮肤免疫学、神经内分泌学、经络腧穴学的研究思路，采用中性红染色法、ELISA 法、免疫组化法探讨白芥子散穴位与非穴位贴敷对施药局部皮肤及肺组织的作用特征，以及其各拆方药味穴位贴敷治疗过敏性哮喘的差异，证实白芥子散贴敷治疗过敏性哮喘的有效性（穴位贴敷明显优于非穴位贴敷），可有效减少过敏性哮喘大鼠BALF 中肥大细胞数并改善脱颗粒现象；明显降低过敏性哮喘大鼠血清中IgE 水平（白芥子起到主要作用）；有效回调肺组织与施药局部皮肤中SP、VIP、CGRP 表达。各拆方药味对施药局部皮肤、肺组织中3 种神经肽表达的影响不尽相同，各组成药味相辅相成，更进一步证实白芥子散配伍应用的科学性。生姜对施药局部皮肤中SP 表达的影响最大，甘遂对施药局部皮肤中VIP、CGRP 表达的影响最大，白芥子对肺组织中3 种神经肽表达的影响最大，延胡索对施药局部皮肤和肺组织中3 种神经肽表达的影响最小。由此提示，穴位贴敷对施药局部皮肤产生的效应与整体功能的调节相联系，这可能是穴位贴敷整体效应产生的作用基础。