基于线粒体Cyt b基因的龙头鱼群体遗传结构分析

郭易佳 杨天燕 孟 玮 韩志强 高天翔

(1. 浙江海洋大学水产学院, 舟山 316022; 2. 浙江省海洋水产研究所, 舟山 316021)

龙头鱼(Harpadon nehereusHamilton, 1822)俗称狗母鱼、九肚鱼、虾潺、豆腐鱼、鼻涕鱼等, 是灯笼鱼目(Myctophiformes), 龙头鱼科(Harpadontidae), 龙头鱼属(Harpadon)常见的一种底层中小型经济鱼类, 广泛分布于西太平洋和印度洋的暖水水域, 我国黄海南部、东海和南海均产之, 尤以浙江温台和舟山近海及福建沿海产量较高, 是定制网和底拖网重要渔获对象[1,2]。作为一种我国重要的经济鱼类, 龙头鱼商业和经济价值已逐渐被人们挖掘和认可。然而, 自20世纪80年代以来, 受过度捕捞和环境污染等因素的影响, 带鱼、大黄鱼、曼氏无针乌贼等传统渔业资源出现严重衰退, 龙头鱼和鳀鲱等小型经济鱼类在渔获物中所占的比例逐年上升, 龙头鱼种群结构及数量分布发生改变, 近年来部分海区甚至出现了低龄化和小型化趋势[3]。目前, 国内外有关龙头鱼的研究较少, 且大多数集中在形态特征[3,4]、资源分布[5]、生理生态[4]和营养加工[6—8]等方面, 分子生物学领域Xu等[9]对龙头鱼线粒体DNA全序列进行了扩增和分析; Xu等[9]、李海燕[10]和Zhu等[11]采用核基因SSR和SRAP分子标记技术对龙头鱼群体遗传多样性进行了研究。迄今为止, 尚未见到基于线粒体DNA序列对我国沿海龙头鱼群体遗传结构的比较分析。

线粒体DNA(mtDNA)结构简单、具有母系遗传特性、不重组、基因进化速度适中等优势, 容易使用相关引物进行扩增和测序。细胞色素b(Cytb)是了解比较清楚的mtDNA蛋白编码基因之一, 也是研究种质资源状况和群体遗传结构的理想分子标记, 近年来成为鱼类遗传多样性研究中常用的标记之一[12,13]。本研究选取我国沿海分布的7个地理种群的龙头鱼为研究对象, 采用线粒体Cytb基因序列作为分子标记, 探讨了龙头鱼群体遗传多样性现状及进化特征, 以期为这一重要渔业资源的保护和开发利用提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究所用龙头鱼样本于2018年7—8月采集自黄海海域的山东青岛(23尾)、江苏南通(22尾)、东海海域的浙江舟山(23尾)、浙江三门(24尾)、福建宁德(24尾)、福建泉州(24尾)，以及南海海域的广东湛江(24尾); 共计164尾样品。所有样品取背部新鲜肌肉组织存放于5 mL离心管, 加入无水乙醇置于-20℃保存备用, 采样地点见图 1。

1.2 基因组DNA提取及PCR扩增

剪取适量背部肌肉组织, 采用传统的酚-氯仿法[14]提取龙头鱼基因组DNA, 将75%乙醇沉淀后经自然风干的DNA溶解于100 μL灭菌水中, 并放于4 ℃保存备用。

采用引物L14734-F(5′-AACCACCGTTGT TATTCAACT-3′)和H15915-R(5′-CTCCGAT CTCCGGATTACAAGAC-3′)扩增龙头鱼线粒体Cytb基因序列。PCR总反应体系为25 μL, 包括0.25 μL浓度为5 U/μL的Taq酶, 正反向引物(10 μmol/L)各1 μL, dNTPs (2.5 mmol/L) 2 μL, 10×buffer缓冲液(含Mg2+) 2.5 μL, 模板DNA (50—100 ng / µL)1 μL,灭菌双蒸水17.25 μL。PCR反应程序为95℃预变性5min, 之后再95℃变性0.5min, 52℃退火0.5min, 72℃延伸1.25min循环35次, 然后72℃延伸5min。用浓度1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物, 凝胶成像系统拍照后, 挑选条带亮度较高的PCR产物送至上海桑尼生物有限公司进行双向测序。

1.3 数据分析

所有序列均由DNAstar[15]软件包进行编辑、校对和排序, 用SeqMan对所有序列结果进行人工校对和分析; 采用软件DnaSP 5.0[16]进行多态位点数目(Number of polymorphic sites)、单倍型数目(Number of haplotype)、核苷酸多样性(Nucleotide diversity)和单倍型多样性(Haplotype diversity)等计算。使用Mega X[17]软件基于Kimura 2-parameter模型计算龙头鱼群体间平均遗传距离, 并采用邻接法(Neighbor joining, NJ)构建单倍型系统发育树, 对数据进行1000次bootstrap重抽样以保证系统树的可靠性。

使用Arlequin软件[18]来统计遗传分化水平, 采用分子变异分析(Analysis of molecular variance,AMOVA)来评估种群间遗传变异。用FST值估算种群的分化水平, 用中性检验中的Tajima’sD和Fu’sFs以及核苷酸不配对分布(Mismatch distribution)来评估种群的历史动态变化。采用公式τ=2ut[19]估算种群扩张时间, 其中τ为扩张时间参数(Tau),u为进化速率;u=μk, 其中μ为每个碱基的变异速率,k为所分析序列的长度,t表示自扩张以来所经历的代数,扩张时间T=t×代时, 龙头鱼通常1龄鱼达性成熟[2],故世代时间取值为1。

2 结果

2.1 序列变异及遗传多样性组成

图 1 龙头鱼采样地点图Fig. 1 Sampling locations of Harpadon nehereus

在164个龙头鱼样本中, 碱基平均组成分别为A=22.84%、T=30.04%、G=16.63%、C=30.48%,A+T含量(52.44%)明显高于G+C (47.56%), G含量最少, 碱基具有明显的偏向性。使用DNAstar软件包中SeqMan和MegAlign程序分析了7个群体164条龙头鱼线粒体Cytb基因序列, 经比对后得到序列长度为1112 bp的基因片段。在164条序列中, 共检测到32个变异位点, 占总位点数的2.88%, 其中单变异位点27个, 占总位点数2.43%; 简约信息位点1个, 占总位点数0.09%。相较于其他海洋鱼类而言, 本研究中龙头鱼群体单倍体多样性指数(Hd)和核苷酸多样性指数(π)整体均处于较低水平(表 1)。其中青岛群体单倍体多样性指数最高(0.4625±0.1283), 舟山群体核苷酸多样性指数最高(0.000549±0.000503),而泉州群体的单倍体多样性指数和核苷酸多样性指数均最低, 分别为0.1630±0.0990和0.000150±0.000233。

164条序列共检测到29个单倍型, 各单倍型在不同群体中的分布情况如表 1和图 2所示, 其中宁德群体24条序列共检测到5个单倍型, 南通群体22条序列共检测到5个单倍型, 青岛群体23条序列共检测到8个单倍型, 泉州群体24条序列共检测到6个单倍型, 三门群体24条序列共检测到6个单倍型,湛江群体24条序列共检测到6个单倍型, 舟山群体23条序列共检测到5个单倍型。在所有检测到的29个单倍型中, 其中单倍型Hap1分布最广, 为全部群体共享, 单倍型Hap3、Hap8、Hap13、Hap14为2—3个群体共享, 剩余单倍型均为一个群体所独有。各单倍型之间关系较近, 大部分单倍型仅经过一步突变完成, 最多的也只经过两步突变(图 2)。

表 1 基于线粒体Cyt b基因的龙头鱼7个种群遗传多样性Tab. 1 Genetic diversity in seven populations of H. nehereus based on mtDNA Cyt b gene

图 2 基于中接法构建的龙头鱼单倍型网络图Fig. 2 Haplotype network diagram of H. nehereus constructed by Median-Joining method图中每个圆圈代表一个单倍型, 圆圈大小代表单倍型分布频率, 不同颜色代表不同群体, 单倍型连线上的数字代表碱基的突变位点Each circle in the figure represents a haplotype, the size of the circle represents the frequency of haplotype distribution, the different colors represent different populations, and the numbers on the haplotype line represent the mutation sites of the base

2.2 群体遗传结构和聚类分析

采用Kimura 2-parameter模型计算龙头鱼7个地理群体的遗传距离得出(表 2), 群体间平均遗传距离为0.00035, 其中青岛(QD)和舟山(ZS)群体间遗传距离最高(0.00051)、泉州(QZ)和湛江(ZJ)群体间遗传距离最低(0.00019)。

遗传多样性指数FST值是衡量一个群体中是否存在随机交配的重要指标, 揭示群体间遗传分化情况。通过对龙头鱼不同群体间遗传分化指数(FST)分析发现(表 3), 群体间总遗传分化固定指数为-0.00105, 两两群体间的FST值介于-0.00807—0.01244,均小于0.05, 表明我国沿海龙头鱼群体间遗传分化很小, 且群体间遗传分化不明显(P＞0.05)。采用Arlequin软件中的分子方差分析法(AMOVA), 对7个群体龙头鱼遗传变异来源和结构进行统计和估算(表 4), 以验证群组间是否存在显著差异。数据结果表明, 龙头鱼的遗传变异主要来自于群体内个体间(100.11%), 其P值检验不显著(P= 0.49663±0.00730),表明群体间存在广泛的基因交流, 遗传差异不显著。

以狗母鱼科(Synodontidae)、狗母鱼属(Synodus)的方斑狗母鱼Synodus kaianus(GenBank登录号： AP004202)和杂斑狗母鱼S. variegatus(GenBank登录号： AY524977)为外群, 采用邻接法(Neighborjoining, NJ)构建单倍型系统发育树(图 3)。从图中可以看出, 在29个单倍型中, 由27个单倍型构成了主要支系, 约占全部单倍型数量的93%, 单倍型Hap3和单倍型Hap27聚到主支系之外。

2.3 群体历史动态及分化时间

使用Arlequin软件在1000次模拟抽样的情况下, 对龙头鱼7个群体的164个个体进行Tajima’sD和Fu’sFs检验来验证中性假说是否成立(表 5)。当Tajima’sD值为负, 且统计学上达到显著水平, 表明偏离中性突变理论模型, 预示着群体在进化过程中除受到了随机漂变因素影响之外, 有可能发生过大规模的群体扩张或者受到过选择压力、瓶颈效应的作用[20]。在Fu’sFs检验中, 如果Fs值大于零, 表明种群趋于稳定, 反之则表明种群趋于扩张[21]。根据结果可知, 所有龙头鱼种群的Tajima’sD统计值皆为负值, 且达到显著性水平(P＜0.05), 具有统计学意义; Fu’sFs检验值也均小于零, 除舟山群体为差异显著(P=0.01920), 其他群体均达到极显著性差异水平(P＜0.01), 表明我国沿海龙头鱼在历史进化过程中曾经历过群体扩张事件。单倍型核苷酸不配对曲线分布(Mismatch distribution)呈明显的单峰泊松分布(图 4), 且中性检验差异显著。综合以上结果表明, 我国沿海龙头鱼群体历史上遭受到瓶颈效应, 后又经历了种群扩张。参照Bermingham等[22]的研究, 采用线粒体Cytb基因2%每百万年的核苷酸分歧速率, 基于核苷酸不配对分布得到不同群体Tau值范围在3.56—14.23, 计算得出龙头鱼群体发生扩张的时间大约在0.08—0.32百万年前的第四纪更新世中晚期。

表 2 龙头鱼不同群体间平均遗传距离Tab. 2 The average genetic distances among different H. nehereus populations

表 3 基于Cyt b序列单倍型频率的龙头鱼群体FST值(对角线下)和相应P值(对角线上)Tab. 3 F-Statistics (below diagonal) and FST P value (above diagonal) from haplotype frequencies of H. nehereus based on Cyt b gene

表 4 龙头鱼群体线粒体Cyt b基因的AMOVA分析Tab. 4 AMOVA analysis of H. nehereus populations based on mtDNA Cyt b gene

3 讨论

3.1 龙头鱼遗传多样性

遗传多样性大小是生物长期进化的产物, 是其生存适应和发展进化的前提。物种遗传多样性越高或遗传变异越丰富, 表明其对环境变化的适应能力就越强。与其他海水鱼类相比[13,23—25], 龙头鱼的遗传多样性水平总体水平表现出低单倍型多样度(0.3026), 低核苷酸多样度(0.000371)的特点, 这与Xu等[9]采用微卫星分子标记对我国沿海9个龙头鱼群体遗传结构检测得出多态性组成较低的结果一致。分子方差分析结果也显示龙头鱼的遗传变异主要来自于群体内个体间, 与Zhu等[9]采用相关序列扩增多态性(Sequence-related amplified polymorphism, SRAP)分子标记技术对龙头鱼群体遗传多样性分析的结果类似, 显示该物种区域性遗传结构不显著。

泉州和湛江群体的遗传多样性水平较低, 推测可能由于台湾海峡的阻隔, 使得携带北部沿海特有单倍型的龙头鱼个体难以通过海峡向南扩散而引起。南通群体遗传多样性水平不高, 也与其特殊的地理环境有关, 淡水的输入和泥沙的沉积对近海海水理化性质等环境因素造成影响, 使得该海域捕获的龙头鱼遗传结构异于其他海区样本。总的来看,在本研究中龙头鱼群体的遗传多样性分布总体上大致呈现由北向南多样性逐渐降低的趋势。文献资料表明, 许多海洋鱼类的遗传多样性分布受到温度变化的影响, 如西北太平洋玉筋鱼(Ammodytes personatus) Cytb基因单倍型频率在地理分布上与水温变化具有相关性, 推测环境温度的改变以及洋流系统对玉筋鱼种群扩散及种群地理分布格局有着重要影响[26]。Xu等[27]对中日沿海5个群体褐菖鲉(Sebastiscus marmoratus) ATP6和Cytb基因所编码的氨基酸替换率进行比较发现, 温度是影响其群体遗传结构的潜在环境因素。根据Fishbase数据库资料显示, 世界范围内龙头鱼分布存在着明显的纬度限制, 推测龙头鱼遗传变异可能与栖息的温度梯度有关, 温度可能是制约其分布的主要因素之一, 随着温度的升高遗传多样性整体呈逐渐降低的趋势。

3.2 龙头鱼地理种群的遗传分化

图 3 基于Cyt b序列构建的龙头鱼单倍型NJ树(方括号内字母代表不同群体)Fig. 3 NJ phylogenetic tree of haplotypes based on Cyt b sequences of H. nehereus (Letters in square brackets represent different populations)

表 5 龙头鱼群体中性检验Tab. 5 Neutral test of fit for H. nehereus

图 4 基于龙头鱼Cyt b基因单倍型的核苷酸不配对分布图Fig. 4 Mismatch distributions based on Cty b gene haplotypes of H. nehereus实线表示预期值, 虚线表示模拟值, 横坐标表示两两配对差异,纵坐标表示频率The solid line indicates the expected value, the broken line indicates the analog value, the abscissa indicates the pairwise difference, and the ordinate indicates the frequency

遗传多样性指数FST是评价群体间遗传分化尺度的指标。根据Wright[28]的研究结论, 本研究中龙头鱼7个群体的FST值均小于0.05, 表明群体间遗传分化不明显。在连续分布的群体中, 群体遗传分化与空间地理距离呈正相关[29], 舟山和三门、宁德两两群体间FST值检验不显著, 推测由于采样点地理距离较近, 且龙头鱼有短距离洄游现象[30],分布范围内存在基因交流使得种群间遗传分化水平偏低。

从群体间遗传距离来看, 湛江和泉州群体间最小, 二者均属南部组群, 也是被台湾海峡所隔离的2个群体, 均属于温度较高的海域; 三门和宁德群体FST值最小, 二者均属于中部组群, 海域环境较为相似。而舟山和青岛群体间遗传距离最大, 三门和泉州群体FST值最大, 分别显示了中部组群与北部组群和南部组群的差异。Xu等[9]的研究结果显示南海组群和东海组群间存在一定遗传差异。潘绪伟和程家骅[30]从东海区龙头鱼群体的数量分布、环境及生物特征为出发点, 推测该海区龙头鱼存在2个群体： 即分布在30°30′—33°30′N、122°30′—126°00′E海域的东海北部群体和分布在27°00′—28°30′N、121 °30′—123°00′E海域的东海南部群体。本研究认为, 根据龙头鱼群体遗传结构差异可划分为3个组群, 即青岛群体为北部组群, 泉州、湛江群体为南部组群, 其他群体(南通、舟山、三门和宁德)为中部组群。因此, 从遗传学角度建议将东海区龙头鱼视为一个组群进行分析和管理。

3.3 龙头鱼种群历史动态

Grant和Bowen[25]提出了一个利用单倍型多样性(Hd)和核苷酸多样性(π)来评估种群的进化历史的模型。在本研究的7个群体中, 青岛和泉州群体的Hd较高(Hd≥0.5), 其他群体的Hd都处于较低水平(Hd≥0.5), 但是所有群体的核苷酸多样性均较低(π＜0.5%), 表明本研究中7个群体的龙头鱼都是从一个数量较小的有效群体, 经过快速扩张来的, 种群近期可能经历了瓶颈效应, 且在之后的扩张过程中形成了奠基者效应[31,32]。

在地球漫长的演化过程中, 温度经常会发生较大波动, 经历多次持续时间较长、影响范围较大的冰川期, 尤其是第四纪更新世冰川期发生的一系列冰川期-间冰期气候回旋, 引发了生物种群的迁徙或灭绝, 对当今生物的空间分布格局和遗传结构产生了深远影响[33]。本研究以校正后的Cytb基因突变速率(2%每百万年)估算出龙头鱼群体发生扩张的时间大约在第四纪更新世中晚期(0.08—0.32百万年前), 这一时期气候的剧烈变化、冰川的前进和退缩, 海平面的大幅升降和气候带的转移, 导致包括龙头鱼在内的西北太平洋大多数鱼类发生不同程度的群体扩张。